ctDNA-Sequenzierungsdienste

Einführung in die ctDNA-Sequenzierung

zirkulierendem Tumor-DNA (ctDNA) ist eine Art von extrazellulärem DNA, die in Körperflüssigkeiten wie Plasma, Serum, Liquor cerebrospinalis usw. vorhanden ist. Es stammt hauptsächlich von nekrotischen oder apoptotischen Tumorzellen, von Tumorzellen sekretierte extrazelluläre Vesikel und zirkulierenden Tumorzellen. Die typische Größe von ctDNA liegt im Bereich von 160-180 Basenpaaren. ctDNA ist eine Untergruppe von zellfreier DNA (cfDNA) und macht einen relativ geringen Anteil (zwischen 0,1% und 1%) aus, was die Detektion herausfordernd macht. Die Reifung von Next-Generation-Sequenzierung (NGS) Die Technologie hat die Sensitivität und Genauigkeit der ctDNA-Detektion erheblich verbessert.

Zirkulierendes zellfreies DNA (cfDNA) besteht hauptsächlich aus Linien-DNA von normalen Zellen, während zirkulierendes Tumor-DNA (ctDNA) bei Krebspatienten relativ selten und stark variabel ist. Folglich sind herkömmliche DNA-Analyseverfahren wie Sanger-Sequenzierung und Pyrophosphat-Sequenzierung fehlt die Sensitivität, die erforderlich ist, um somatische Mutationen in Plasma-ctDNA von Krebspatienten nachzuweisen. Derzeit gibt es drei Hauptanalysemethoden für ctDNA: quantitative PCR-Techniken, die durch ARMS repräsentiert werden, digitale PCR-Techniken, die durch ddPCR repräsentiert werden, und Hochdurchsatz-Detektionstechniken, die auf Next-Generation Sequencing (NGS)In den letzten Jahren sind auch die Massenspektrometrie von Nukleinsäuren und EFIRM-Technologien aufgetaucht.

Um den Durchsatz und die Effizienz der Detektion zu steigern, konzentrieren sich Sequenzierungstechnologien auf NGS werden häufig für die nachgelagerte Analyse von ctDNA verwendet, die von Whole-Genome oder Whole-Exom-Sequenzierung zur gezielten Sequenzierung eines begrenzten Genoms. NGS ermöglicht eine hochdurchsatzfähige parallele Tiefensequenzierung mehrerer Gen-Nukleinsäuresegmente, die die gleichzeitige Erkennung mehrerer Gene, verschiedener Formen (wie Mutationen, Veränderungen der Kopienzahl und Genfusionen) sowie unbekannter Mutationen erleichtert. Die Beteiligung mehrerer Gene an der Prognose und der Bewertung der Behandlungseffizienz könnte erhebliche Auswirkungen auf die prognostischen Ergebnisse haben.

Merkmale der Sequenzierung von zirkulierender Tumor-DNA

Bequeme StichprobeNicht-invasive, Echtzeit-, mehrfach zugängliche ctDNA-Analysen werden durch die Entnahme von Blut erreicht, wodurch die Risiken und Unannehmlichkeiten invasiver Methoden wie Biopsien und Operationen zur Entnahme von Tumorgewebe beseitigt werden. In den frühen Stadien bösartiger Tumoren können Veränderungen im ctDNA-Gehalt und in Genen nachgewiesen werden.

ReifedetektionstechnologieHohe Empfindlichkeit, hohe Genauigkeit, niedrige falsch-positive Rate Nutzung NGS Die ctDNA-Detektion gewährleistet eine hohe Sensitivität und Genauigkeit und erkennt Mutationen bereits ab 0,1 %. Im Vergleich zu anderen Tumormarkern weist ctDNA eine höhere Sensitivität auf, was sie zu einem idealen Tumorbiomarker macht.

Umfassende Erkennung: Breites Anwendungsgebiet Fast alle Tumorzellen setzen DNA-Fragmente in den Blutkreislauf frei. Folglich spiegelt ctDNA den Gesamtstatus der Tumoren im Körper wider. Die Heterogenität hat einen erheblichen Einfluss auf Gentests in Tumorgeweben, aber die ctDNA-Detektion mindert die Zufälligkeit und Lokalität, die mit der Heterogenität von Tumorgeweben verbunden sind. Dies gewährleistet umfassendere und zuverlässigere Ergebnisse für Tumormutationen.

Vorteile der ctDNA-Sequenzierung

• Umfassender Service: Wir bieten einen Rundum-Service, der den gesamten Prozess von der ctDNA-Extraktion über die Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung bis hin zur Datenanalyse abdeckt.
• Ultra-niedriger ctDNA-Eingang: Unsere Technologie ermöglicht das Sequenzieren mit Ausgangs-ctDNA-Mengen von nur 10 ng.
• Strenge Qualitätskontrolle: Ein rigoroser Qualitätskontrollprozess wird in jeder Phase umgesetzt, um eine hohe Genauigkeit der Ergebnisse, die unseren Kunden bereitgestellt werden, sicherzustellen.
• Spezialisierte Bioinformatikanalyse: Unser kompetentes Bioinformatik-Team ist in der Lage, die individuellen Datenanalyseanforderungen unserer Kunden zu erfüllen.

Anwendung der ctDNA-Sequenzierung

• Erkennung von Krebs im Frühstadium: Durch die Untersuchung von zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) im Blutstrom wird es möglich, tumorspezifische Mutationen in den frühen Stadien zu identifizieren, wodurch die Chancen auf eine frühzeitige Diagnose verbessert werden.
• Krebsüberwachung: Die dynamische Überwachung der ctDNA-Spiegel bei Patienten bietet Einblicke in die Variationen der Tumorlast und ermöglicht eine Bewertung der Wirksamkeit von Behandlungen und des Krankheitsverlaufs.
• Rückfallvorhersage: Das Wiederauftreten oder die Erhöhung der ctDNA-Spiegel in postoperative oder nachbehandelnde Nachuntersuchungen kann potenziell auf ein Wiederauftreten von Krebs hinweisen.
• Personalisierte Therapie: Durch die Analyse der Ergebnisse der ctDNA-Sequenzierung können Kliniker maßgeschneiderte Behandlungsregime entwerfen, indem sie gezielte Therapien wählen oder die Behandlungsstrategien entsprechend anpassen.

Unser bereitgestellter ctDNA-Sequenzierungsdienst

Whole-Genome-Resequenzierung für ctDNA

Wir bieten umfassende Whole-Genome-Resequenzierung für ctDNA an, die die Analyse verschiedener Arten von Mutationen ermöglicht, die von ctDNA getragen werden, wie z. B. Einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs), Insertionen und Deletionen (Indels) sowie große strukturelle Variationen.

Exom-Sequenzierung für ctDNA

Ähnlich wie konventionelle genomische DNA kann eine ausreichende Menge an ctDNA einer Exomsequenzierung unterzogen werden, um Variationen in den kodierenden Regionen zu erkennen.

Methylierungssequenzierung für ctDNA

Die Methylierungssequenzierung für ctDNA ist ein Schwerpunkt in der Forschung. Dazu gehört die Erkennung von Methylierungsstellen für einzelne Gene sowie die umfassende Erkennung von Methylierungsstellen im gesamten Genom.

Gezielte Regionssequenzierung für ctDNA

Unser Zielregionen-Panel für ctDNA ermöglicht die Erkennung und Analyse spezifischer Zielorte. Im Vergleich zu Whole-Genome-SequenzierungDiese Methode bietet eine kostengünstigere Lösung.

Abbildung 1. Schematische Übersicht der Hauptschritte zur Verarbeitung von Blutproben und zur Extraktion von cfDNA. (Bohers et al., 2021)

ctDNA-Sequenzierungs-Workflow

CD Genomics bietet schnelle und präzise ctDNA-Sequenzierungsdienste sowie bioinformatische Analysen an.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Probenarten: Plasma, Serum oder cfDNA von Krebspatienten. Plasma wird empfohlen, um Störungen durch lymphozytär abgeleitetes cfDNA zu minimieren. Probemenge: Plasma > 5 mL; Serum > 10 mL; cfDNA > 10 ng. Plasma-Extraktion: 1. Sammeln Sie Vollblut in EDTA-Antikoagulantienröhrchen, vermeiden Sie das Einfrieren; lagern Sie es kurz bei 2-8℃, bevor Sie es umgehend bei niedriger Temperatur zentrifugieren, um Plasma zu gewinnen. 2. Wenn eine Niedertemperaturzentrifugation nicht möglich ist, verwenden Sie STRECK nicht-invasive Röhren mit einem proprietären Stabilisator zur Erhaltung von Vollblut, die eine Zentrifugation bei Raumtemperatur ermöglichen. 3. Um verbleibende Zellen zu eliminieren, sollte das Plasma einer sekundären Zentrifugation unterzogen werden: zunächst bei 4℃ bei 1600g für 10 Minuten, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation bei 4℃ bei 16000g für 10 Minuten. Probenlagerung: Gefrieren Sie Plasma- und Serumproben schnell in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei -80℃. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier- Auftauzyklen während der Probenlagerung. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Illumina-Plattform HiSeq 2000
	Bioinformatische Analyse Qualitätskontrolle von Rohdaten Datenbereinigung Referenzgenom-Ausrichtung Variant-Identifizierung Variantenannotation Variantenfilterung Tumorspezifische Variantenanalyse Tumorlastbewertung …und mehr Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur ctDNA-Sequenzierung für Ihre Schreibanpassung.

Referenzen

1. Michail Ignatiadis et al. Flüssige Biopsie betritt die Klinik - Implementierungsfragen und zukünftige Herausforderungen. Nat Rev Klin Onkol. 2021 M
2. Ming Chen, Next-Generation-Sequenzierung in der Flüssigbiopsie: Krebs-Screening und Früherkennung. Hum-Genomik2019 Aug 1;13(1):34.
3. Carolin M Sauer, Langzeitüberwachung der Krankheitslast und Reaktion mittels ctDNA aus getrockneten Blutproben in Xenograft-Modellen. EMBO Mol Med. 2022
4. Etienne Giroux Leprieur, Sequenzielle ctDNA-Whole-Exom-Sequenzierung bei fortgeschrittenem Lungenadenokarzinom mit anfänglicher dauerhafter Tumorreaktion auf Immun-Checkpoint-Inhibitoren und späterer Progression. J Immunther Krebs. 2020
5. Anjui Wu, Genomweite Plasma-DNA-Methylierungsmerkmale von metastasiertem Prostatakrebs. J Clin Invest. 2020
6. Jianxia Chen et al. Entwurf eines gezielten Sequenzierungsassays zur Erkennung seltener Mutationen in zirkulierender Tumor-DNA. Genetischer Test Molekulare Biomarker. 2019
7. Bohers E, Viailly P J, Jardin F. cfDNA-Sequenzierung: technologische Ansätze und bioinformatische Probleme. Pharmazeutika, 2021, 14(6): 596.

Demo-Ergebnisse

Referenzen

1. Chen, KZ., Lou, F., Yang, F. et al. Nachweis von zirkulierender Tumor-DNA bei Patienten mit frühzeitigem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs durch gezielte Sequenzierung. Wissenschaftliche Berichte, 2016, 6, 31985.
2. Deveson I W, Gong B, Lai K, et al. Bewertung der analytischen Validität von Sequenzierungsassays für zirkulierende Tumor-DNA in der präzisionsonkologie. Naturbiotechnologie, 2021, 39(9): 1115-1128.

ctDNA-Seq Häufig gestellte Fragen (FAQs)

1. Was sind die Vor- und Nachteile von ctDNA im Vergleich zu histologischen Tests?

• Vorteile: Im Vergleich zu histologischen Tests bietet die ctDNA-Analyse nicht-invasive oder minimal-invasive Methoden, erleichtert wiederholte Probenahmen und hat kürzere Zeiten für Sammlung, Verarbeitung und Berichterstattung. Sie kann die räumliche Tumorheterogenität überwinden und bietet Echtzeit- sowie relativ umfassende Einblicke in die molekularen Eigenschaften des Tumors eines Patienten. Darüber hinaus kann Plasma-ctDNA auch die Nachweisrate von Treibermutationen erhöhen.
• Nachteile: Im Gegensatz zu Gewebeproben hat ctDNA im peripheren Blut einen geringeren Gehalt, was zu falsch-negativen klinischen Testergebnissen führen kann. Das Vorhandensein von Keimbahnvariationen oder Mutationen der klonalen Hämatopoese könnte ebenfalls zu falsch-positiven Ergebnissen führen, wenn keine weißen Blutkörperchen als Kontrolle verwendet werden. Darüber hinaus gibt es Unterschiede in den Mengen an ctDNA, die von verschiedenen Krebspatienten oder demselben Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten in den Blutkreislauf freigesetzt werden, was Herausforderungen für klinische Tests und die Interpretation der Ergebnisse mit sich bringt.

2. Warum erfordert der ctDNA-Test eine höhere Sensitivität?

Die Anzahl der Tumorzellen im Körper eines Krebspatienten ist erheblich geringer als die der normalen Zellen, und die cfDNA-Spiegel im Plasma sind im Allgemeinen niedrig. ctDNA macht nur 0,1 % bis 5 % der cfDNA aus, mit erheblichen Unterschieden in den ctDNA-Spiegeln im Plasma zwischen verschiedenen Krebsarten und Krankheitsstadien. Daher erfordert die ctDNA-Detektion im Vergleich zu Gewebeuntersuchungen eine höhere Sensitivität und Spezifität.

Aktuelle Technologien, die für die Flüssigbiopsie von ctDNA verwendet werden, umfassen überwiegend ARMS-PCR, digitale PCR (ddPCR) und Next-Generation-Sequenzierung (NGS).

3. Was ist nicht-targetierte Sequenzierung in der ctDNA-Analyse?

Die nicht gezielte Sequenzierung in der ctDNA-Analyse bezieht sich auf den Ansatz, ctDNA zu untersuchen, ohne einen vorher festgelegten Fokus auf spezifische Veränderungen zu legen, eine Methodik, die umfasst Whole Exome Sequenzierung (WES) und Whole Genome Sequenzierung (WGS). WGS wurde insbesondere für die ctDNA-Analyse genutzt, da es die Fähigkeit besitzt, tumorspezifische Variationen ohne vorheriges Wissen über potenzielle Mutationen aufzudecken. Dies ermöglicht die Identifizierung von Genveränderungen, die mit einer Resistenz gegen Behandlungen verbunden sind, sowie die Bestimmung neu identifizierbarer Zielstrukturen. Dennoch bringt WGS Nachteile mit sich, wie niedrigere Sensitivitätsraten von 5-10 %, erhöhte Kosten, längere Erkennungszeiten und eine gesteigerte Komplexität in der Datenanalyse, was die Integration in die klinische Praxis zu einer herausfordernden Aufgabe macht.

4. Wie wird das gezielte Sequenzieren in der ctDNA-Analyse durchgeführt?

Gezielte Sequenzierung kann Zielfragmente durch PCR oder Hybridfängung anreichern. PCR-basierte gezielte Sequenzierungsdesigns verwenden Dutzende bis Hunderte von PCR-Primern, die auf spezifische Gene abzielen, um diese anzureichern. Hybridfängung-basierte gezielte Sequenzierungsdesigns entwerfen Sonden, die auf spezifische Gene abzielen, und reichern diese durch Hybridfängung an.

5. Welche Strategien werden verwendet, um die Sensitivität und Spezifität in der ctDNA-Analyse zu verbessern?

Aufgrund der Komplexität von Next-Generation-Sequenzierung (NGS) Arbeitsabläufe, Fehler, die während der Bibliothekskonstruktion eingeführt werden, Zielfragmentanreicherung und Sequenzierung führen unvermeidlich zu Hintergrundgeräuschen. Diese Hintergrundgeräusche können niedrigfrequente Mutationen in ctDNA-Proben verdecken, was zu falsch-negativen oder falsch-positiven Ergebnissen führt und die Sensitivität und Spezifität der ctDNA-Detektion einschränkt. Daher zielen die meisten auf NGS basierenden gezielten Sequenzierungstechnologien darauf ab, Hintergrundgeräusche zu reduzieren und die Sensitivität und Spezifität zu verbessern, oft unter Verwendung von molekularen Barcode-Strategien. Zunächst wurden einzelsträngige DNA-Barcodes verwendet, aber jetzt nutzen die meisten Strategien doppelsträngige DNA-Barcodes. Während doppelsträngige Barcodes eine bessere Fehlerunterdrückung bieten, haben sie eine relativ geringere Effizienz, was sie in klinischen Anwendungen weniger optimal für begrenzte cfDNA-Proben macht.

ctDNA-Sequenzierungs-Fallstudien

Zirkulierende Tumor-DNA-Sequenzierungsanalyse von gastroösophagealem Adenokarzinom

Zeitschrift: Klinische Krebsforschung
Impactfaktor: 10,86
Veröffentlicht: 1. Dezember 2019

Hintergrund

Gastroösophageales Adenokarzinom (GEA) ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem mit begrenzten Überlebensraten trotz optimaler Behandlungen. Obwohl gewebebasierte Next-Generation Sequencing (NGS) hat wichtige genomische Veränderungen (GAs) identifiziert, jedoch erschwert die Heterogenität innerhalb der Patienten die gezielte Therapie. Neuere Studien deuten darauf hin, dass ctDNA-NGS, das eine nicht-invasive Methode bietet, die Auswahl der gezielten Therapie besser leiten könnte, indem es einen umfassenden Überblick über GAs bietet und einige Einschränkungen von Gewebe-NGS überwindet. Diese Studie analysiert eine große Kohorte von GEA-Patienten mithilfe von ctDNA-NGS, um die Nachweisgrenzen, die Korrelation mit klinischen Ergebnissen und das Potenzial zur Vorhersage der Therapieantwort und -resistenz zu bewerten.

Methoden

Ergebnisse

Plasma-cfDNA-Tests basieren auf der Freisetzung von Tumor-DNA (ctDNA) in den Blutkreislauf, die sich mit normalem cfDNA vermischt. Die maximale somatische Variantenallelfrequenz (maxVAF) spiegelt den größten ctDNA-Klon wider und hilft, die gesamte ctDNA-Menge und Subklonalität zu schätzen. Bei unbehandelten Patienten im Stadium IV korreliert eine höhere maxVAF mit einer größeren Krankheitslast und spezifischen Metastasierungsorten, was darauf hinweist, dass sowohl der Ort als auch das Ausmaß der Erkrankung die ctDNA-Freisetzung und die Nachweisempfindlichkeit erheblich beeinflussen.

Abb. 1. Die ctDNA-Detektion und die Anzahl der erkannten Veränderungen werden durch spezifische Krankheitsorte und die Krankheitslast bestimmt.

Die klinische ctDNA-NGS wird verwendet, um umsetzbare genomische Veränderungen (GAs) zu identifizieren und kann potenziell als prognostischer Biomarker sowohl für frühe als auch für späte Krankheitsstadien dienen. Bei lokal fortgeschrittenen Patienten war nachweisbares ctDNA mit einer kürzeren krankheitsfreien Überlebenszeit assoziiert, und die ctDNA-Spiegel nach der Operation sagten ein Wiederauftreten voraus. Bei fortgeschrittenen Stadium-IV-Patienten korrelierten höhere ctDNA-Spiegel (maxVAF) mit einer schlechteren Prognose. Die serielle ctDNA-NGS-Analyse zeigte, dass ein signifikanter Rückgang des maxVAF während der Erstlinientherapie mit einem besseren Überleben vorhergesagt wurde. Unter den mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren behandelten Patienten war ein niedrigerer maxVAF mit einer längeren Gesamtüberlebenszeit verbunden.

Abb. 2. Prognostische Implikationen von maxVAF und seriellen Veränderungen in den perioperativen und neu diagnostizierten metastatischen Einstellungen.

Bei der Erstdiagnose ist die räumliche Heterogenität von HER2 und anderen genomischen Veränderungen (Gas) bei GEA-Patienten signifikant. In einer Studie mit 34 unbehandelten GEA-Patienten im Stadium IV zeigten ctDNA-NGS und Gewebe-NGS von primären und metastatischen Stellen, dass nur 26 % der Gas in allen Proben übereinstimmten, was den komplementären Wert beider Methoden hervorhebt. CtDNA-NGS erkannte auch zeitliche Heterogenität und erworbene Resistenzmutationen nach der Therapie, die die optimalen nachfolgenden Behandlungen leiten können. Dies unterstreicht die Bedeutung der Kombination von ctDNA-NGS mit Gewebe-NGS für eine umfassende Bewertung der Tumorheterogenität und der Resistenzmechanismen.

Abb. 3. Intrapatientliche räumliche und zeitliche Heterogenität durch multisite Gewebe-NGS und ctDNA-NGS.

ctDNA-NGS kann prognostische und prädiktive genomische Veränderungen (GAs) bei GEA-Patienten identifizieren. Mutationen in PIK3CA und BRAF sind mit einer schlechten Überlebensrate verbunden, während HER2- und EGFR-Amplifikationen, die sowohl durch ctDNA-NGS als auch durch Gewebe-NGS identifiziert werden, bessere Ergebnisse mit gezielten Therapien vorhersagen. Die Kombination von ctDNA-NGS mit Gewebe-NGS verbessert die Erkennung von GAs und bietet eine umfassendere Bewertung zur Unterstützung von Behandlungsstrategien.

Abb. 4. Überlebensanalyse von unbehandelten Patienten mit Stadium IV GEA nach spezifischem GA.

Fazit

Diese Studie, die größte ihrer Art, verwendete ctDNA-NGS zur Analyse von 1.630 GEA-Patienten. Sie legte die Nachweisgrenzen fest, bestätigte den prognostischen Wert von verbleibendem ctDNA nach der Operation und kartierte die GA-Landschaft, wobei gezeigt wurde, dass ctDNA-NGS umsetzbare GAs und Resistenzmechanismen genau identifiziert. Die Kombination von ctDNA-NGS mit Gewebe-NGS verbessert die Detektion und deutet darauf hin, dass ctDNA-NGS die Überwachung und Behandlung von GEA verbessern kann, obwohl weitere Validierungen erforderlich sind.

Referenz

1. Maron S B, Chase L M, Lomnicki S u. a. Analyse der Sequenzierung von zirkulierender Tumor-DNA bei gastroösophagealem Adenokarzinom. Klinische Krebsforschung, 2019, 25(23): 7098-7112.