Exosme Forschungsübersicht

Extrazelluläre Vesikel (EVs), allgemein als Exosomen bezeichnet, sind ein allgegenwärtiges Merkmal im Bereich der Zellbiologie. Forschungen haben eindeutig gezeigt, dass diese Vesikel nicht nur von eukaryotischen Zellen sekretiert werden, sondern auch von allen prokaryotischen Zellen produziert werden, was ihre Verbreitung erweitert. Innerhalb mehrzelliger Organismen werden Exosomen in eine Vielzahl von Körperflüssigkeiten verteilt, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Muttermilch, Fruchtwasser, Aszites, Liquor cerebrospinalis, Galle, Samen und mehr.

Diese Vesikel werden in der wissenschaftlichen Literatur oft unter verschiedenen Namen geführt, basierend auf ihrem Ursprung, ihrer Natur und ihren Eigenschaften. Obwohl es keine allgemein akzeptierte Definition gibt, gibt es eine allgemeine Kategorisierung, die zwischen Exosomen, abgebenden Vesikeln, Mikropartikeln und Mikrov vesikeln (MV) unterscheidet, die typischerweise eine Größe von 150 bis 1000 Nanometern aufweisen und durch Knospung von der Zellmembran gebildet werden. Im Gegensatz dazu sind Exosomen eine Unterart von EVs, die durch ihre lipiddoppelschichtige Membranstruktur gekennzeichnet sind. Sie haben einen Durchmesser von etwa 30-100 Nanometern und werden intrazellulär innerhalb von multivesikulären Körpern (MVBs) durch die Fusion mehrerer Endosomen mit der Zellmembran gebildet.

Zusammensetzung von Exosomen

Exosomen bestehen aus einer Vielzahl von Komponenten. Im Jahr 1981 konzipierten Trams und Kollegen erstmals die Idee der Exosomen, als sie Vesikel entdeckten, die von Zellen mit extrazellulärer Enzymaktivität sekretieren. Dieses Konzept wurde später auf Vesikel angewendet, die während der Differenzierung von Retikulozyten freigesetzt werden, die typischerweise einen Durchmesser von etwa 30 bis 100 Nanometern aufweisen. Im Laufe der folgenden Jahre wurde offensichtlich, dass verschiedene Zelltypen, einschließlich B-Lymphozyten, dendritischer Zellen, T-Zellen, Mastzellen, neuronaler Zellen, Endothelzellen und Epithelzellen, Exosomen sekretieren können. Darüber hinaus enthalten auch mehrere Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel, Muttermilch, Fruchtwasser, Aszites, Liquor cerebrospinalis, Galle und Samen Exosomen.

Exosomen teilen gemeinsame Proteinbestandteile, die an Membrantransport und Fusion beteiligt sind, einschließlich GTPasen, Annexinen, Flotillinen sowie Transmembranproteinen wie CD9, CD63, CD81 und CD82. Hitzeschockproteine (Hsc70 und Hsp90), Proteine der Vesikelbiogenese (Alix und TSG101), lipidassoziierte Proteine und Phospholipasen sind ebenfalls in allen Arten von Exosomen vorhanden. Derzeit wurden über 4500 verschiedene Proteine in Exosomen identifiziert. Neben Proteinen enthalten Exosomen eine Vielzahl von Lipiden wie Cholesterin, Sphingolipide und langkettige Glycerophospholipide.

Darüber hinaus beherbergen Exosomen eine Vielzahl von RNA-Spezies, die bestehen aus messenger-RNA (mRNA), MikroRNA (miRNA)und verschiedene nicht-kodierende RNAs, insbesondere kleine nukleäre RNA (snRNA), kleine nukleoläre RNA (snoRNA), kleine Cajal-Körper-spezifische RNA (scaRNA), piwi-interagierende RNA (piRNA), lange nicht-kodierende RNA (lncRNA), und zirkuläre RNA (circRNA)Die Mehrheit dieser RNA-Moleküle, die innerhalb von EVs identifiziert wurden, weist Längen von 20 bis 200 Nukleotiden auf. Dieses Spektrum umfasst vollwertige miRNAs und tRNAs sowie fragmentierte Formen von mRNA und rRNA.

Was sind die Funktionen von Exosomen?

Exosomen, die bei ihrer Entdeckung zunächst als zellulärer Abfall wahrgenommen wurden, haben in den letzten Jahren aufgrund ihrer entscheidenden Rolle in der interzellulären Kommunikation an Bedeutung gewonnen. Diese kleinen, membranumschlossenen Vesikel werden mittlerweile für ihren Inhalt an zellspezifischen Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren anerkannt, die als Signalmoleküle fungieren, wenn sie an empfangende Zellen übertragen werden, und somit deren zelluläre Funktionen beeinflussen. Exosomen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Antigenpräsentation des Immunsystems, Tumorwachstum und Metastasierung, Geweberegeneration nach Verletzungen, programmierter Zellapoptose, vaskulärer Regeneration, Entzündung, Blutgerinnung, Pathogenverbreitung und mehr. Verschiedene Zelltypen sekretieren Exosomen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Funktionen, was sie wertvoll als Biomarker für die Krankheitsdiagnose macht. Aufgrund ihrer Lipid-Doppelschicht-Membranstruktur bieten Exosomen effektiven Schutz für ihre Fracht und können gezielt auf bestimmte Zellen oder Gewebe ausgerichtet werden, was sie zu einer vielversprechenden Plattform für die Arzneimittelverabreichung macht.

Angesichts des zunehmenden Schwerpunkts auf der Präzisionsmedizin wächst das Interesse an einer genauen Krankheitsdiagnose und maßgeschneiderten Behandlungen. Exosomen, ein aufkommendes und neuartiges Forschungsfeld, bieten einen vielversprechenden Ansatz in diesem Bestreben. Ihre Allgegenwart im Körper und die einfache Gewinnung machen sie zu einem potenziell effektiven Ansatz für die Krankheitsdiagnose und -behandlung. Dies unterstreicht ihr erhebliches Potenzial zur Weiterentwicklung des Bereichs der Präzisionsmedizin.

Isolation von extrazellulären Vesikeln

Ultrazentrifugation

Die Ultrazentrifugation ist eine gängige Methode zur Isolierung von Exosomen und kann zusammen mit der Sukrose-Dichtegradientenzentrifugation oder der Sukrose-Puffertrennung für Exosomen mit geringer Abundanz eingesetzt werden. Obwohl diese Methode einfach zu handhaben ist, hat sie Einschränkungen, wie die Fähigkeit, aufgrund von Rotorbeschränkungen nur bis zu sechs Proben gleichzeitig zu verarbeiten, und der Ertrag kann inkonsistent sein, was möglicherweise mit der Art des verwendeten Rotors zusammenhängt. Die Ultrazentrifugation erfordert außerdem eine beträchtliche Menge an Ausgangsmaterial, und der Ertrag sowie die Reinheit der gewonnenen Exosomen können fraglich sein. Darüber hinaus können wiederholte Zentrifugationsschritte potenziell Vesikel schädigen, was zu einer Verringerung ihrer Qualität führen kann. Wenn die Ultrazentrifugation jedoch mit der Sukrosegradientenzentrifugation kombiniert wird, kann sie hochreine Exosomen liefern, obwohl dieser Ansatz relativ zeitaufwendig ist.

Magnetische Perlen-Immunaffinität

Exosomen besitzen spezifische Oberflächenmarker wie die Proteine CD63 und CD9. Durch die Inkubation von Exosomen mit magnetischen Perlen, die mit Antikörpern gegen diese Marker beschichtet sind, können Exosomen gefangen und isoliert werden. Die magnetische Perlen-Immunaffinität bietet Vorteile wie hohe Spezifität, einfache Handhabung und minimale Auswirkungen auf die Integrität der Exosomenmorphologie. Allerdings hat sie auch Nachteile, darunter eine geringere Effizienz, die Anfälligkeit der biologischen Aktivität von Exosomen für pH- und Salzkonzentrationsvariationen, die nachgelagerte Experimente behindern können, sowie eine begrenzte allgemeine Anwendbarkeit.

PEG-basierte Fällungsmethode

Polyethylenglykol (PEG) kann verwendet werden, um hydrophobe Proteine und Lipidmoleküle gemeinsam auszufällen. Ursprünglich wurde es zur Virusisolierung aus Proben wie Serum eingesetzt, wird jetzt jedoch auch zur Ausfällung von Exosomen verwendet. Das Prinzip hinter dieser Technik könnte eine wettbewerbsfähige Bindung an freie Wassermoleküle umfassen.

Die Verwendung von PEG zur Fällung von Exosomen bringt jedoch mehrere Herausforderungen mit sich. Dazu gehören Probleme mit der Reinheit und dem Ertrag, eine erhöhte Präsenz von Verunreinigungen (die zu falsch positiven Ergebnissen führen können), nicht einheitliche Partikelgrößen, die Bildung von schwer entfernbaren Aggregaten und die potenzielle Störung von Exosomen durch mechanische Kräfte oder chemische Zusätze wie Tween-20. Folglich könnten Studien, die PEG-Fällung zur Isolation von Exosomen verwenden, bei der Veröffentlichung auf Kritik stoßen.

Reagenzbasierte Extraktion

In den letzten Jahren sind verschiedene kommerzielle Reagenz-Kits zur Extraktion von Exosomen auf dem Markt erschienen. Einige dieser Kits verwenden speziell entwickelte Filter, um Verunreinigungen zu entfernen, während andere die Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Trennung und Reinigung nutzen. Es gibt auch Kits, die auf Methoden der Verbindungsfällung basieren, um Exosomen auszufällen. Diese Reagenz-Kits erfordern keine spezielle Ausrüstung, und da sie kontinuierlich aktualisiert und verbessert werden, steigt ihre Extraktionseffizienz und Reinigungswirkung allmählich. Folglich ersetzen sie zunehmend die Ultrazentrifugationsmethoden und finden breitere Anwendung.

Identifizierung isolierter Exosomen

Elektronenmikroskopische Identifizierung

Der direkteste Ansatz zur Identifizierung von Exosomen besteht darin, sie unter einem Elektronenmikroskop zu beobachten. Bei einer typischen Elektronenmikroskopie-Untersuchung von Exosomen erscheinen diese Vesikel als kugelförmige oder becherförmige Strukturen, die Größen im Bereich von 30 bis 100 Nanometern aufweisen.

Western-Blot-Identifizierung

Nach der Isolation von Exosomen kann eine Western-Blot (WB)-Analyse mit spezifischen exosomenassoziierten Proteinen durchgeführt werden. WB umfasst typischerweise Proteine, die mit der Synthese von multivesikulären Körpern (MVBs) in Verbindung stehen, wie Alix und TSG101, sowie Tetraspanin-Transmembranproteine (CD9, CD63, CD81, CD82). Es ist auch ratsam, nicht-exosomale Marker in das WB aufzunehmen, wie GRP94, EEA1, Cytochrom c, GM130, PMP70, Calreticulin und Prohibitin, die in Exosomen nicht vorhanden sind und exklusiv für Gesamtzellproteine sind.

Wie man extrahiert Exosomen-RNA

Sobald extrazelluläre Vesikel (EVs) isoliert sind, kann RNA direkt mit den folgenden Methoden extrahiert werden:

Isolieren Sie EVs mit einem kommerziellen Kit und extrahieren Sie dann RNA mit einem RNA-Extraktionskit.

Isolieren Sie EVs mit einem kommerziellen Kit und verwenden Sie anschließend ein passendes RNA-Extraktionskit, das für EVs entwickelt wurde.

Unsere vergleichenden Experimente haben gezeigt, dass Strategie 1 überlegene Extraktionsergebnisse liefert.

Exosomenforschung Anwendung

In-vivo-Bildgebung bestätigt die weitverbreitete Lieferung von Exosomen.

Am 21. Mai 2015 wurde eine bahnbrechende Entdeckung im Bereich der Krebsmetastasenforschung in der renommierten Zeitschrift "Cell" veröffentlicht. Die Studie wurde von einem Forschungsteam des Hubrecht Instituts durchgeführt. Ihre Forschung bestätigte, dass Krebszellen im Prozess der Metastasierung spezifische Verhaltensweisen auf weniger bösartige Krebszellen übertragen können. Diese bedeutende Erkenntnis bietet wertvolle Einblicke in das Verhalten von Krebs und birgt das Potenzial zur Verbesserung der Krebsdiagnose und -behandlung.

Krebs entsteht aus der Ansammlung genetischer Fehler in der DNA von Zellen. Einige dieser Fehler führen dazu, dass Zellen Signale ignorieren, die das Wachstum und die Differenzierung steuern, was zu unkontrollierter Zellteilung führt. Dies führt letztendlich zum Tumorwachstum, wobei Tumorzellen immer mehr Fehler ansammeln. Da jeder dieser DNA-Fehler in einzelnen Tumorzellen einzigartig ist (Tumorheterogenität), kann sich auch das Verhalten dieser einzelnen Tumorzellen unterscheiden. Diese Komplexität macht die Behandlung von Krebs herausfordernd, da spezifische Kombinationen von DNA-Fehlern einige Tumorzellen resistent gegen Behandlungen machen können.

Um ein besseres Verständnis für das Verhalten einzelner Tumorzellen zu gewinnen, entwickelten Forscher spezialisierte Mikroskopietechniken, einschließlich der In-vivo-Mikroskopie, um die Aktivitäten von Krebszellen in lebenden Organismen festzuhalten. Sie wiesen Tumorzellen mit unterschiedlichen DNA-Fehlern verschiedene Farben zu, indem sie fluoreszierende Marker verwendeten. Durch die Abbildung dieser gefärbten Zellen wurde deutlich, welche Zellen mobil waren und in der Lage waren, Metastasen im Körper einzuleiten.

Invasive maligne Krebszellen (blau) setzen sehr kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, wie Exosomen und Mikrov vesikel, die Moleküle enthalten, die zelluläre Malignität induzieren können. Weniger maligne Zellen (rot) nehmen diese EVs auf, was ihr Verhalten verändert. Weniger maligne Zellen werden malignere und initiieren Metastasen (grün).

Wissenschaftler haben auch bestätigt, dass diese gefährlichen EVs durch den Blutkreislauf zu anderen Tumorstellen reisen können und bösartiges Verhalten über lange Strecken replizieren.

Exosomen bestimmen die Organ-Spezifität von Tumormetastasen.

Der führende Beitrag zu krebsbedingten Todesfällen ist die Verbreitung von Krebszellen von ihrem primären Standort zu entfernten Organen über das Kreislaufsystem. Dieser metastatische Prozess ist nicht stochastischer Natur. Vielmehr folgen spezifische Untergruppen von Krebszellen komplexen molekularen Wegen, die es ihnen ermöglichen, gezielt bestimmte Organe anzusprechen und Kolonien innerhalb dieser zu etablieren. Diese gezielte Migration beinhaltet ein dynamisches Zusammenspiel zwischen den Krebszellen, oft umgangssprachlich als die "Samen" bezeichnet, und dem Mikroumfeld im Zielorgan, das allgemein als der "Boden" bekannt ist.

Jüngste wissenschaftliche Untersuchungen haben ein faszinierendes Phänomen aufgedeckt, das darauf hindeutet, dass sie, bevor die metastatischen "Samen" eintreffen, das Mikroumfeld, oft als "Boden" bezeichnet, durch die Nutzung von extrazellulären Vesikeln, insbesondere Exosomen, modulieren können. Exosomen werden kurz als winzige extrazelluläre Vesikel charakterisiert, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Molekülen, einschließlich Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren, zwischen Zellen zu transportieren. Diese Vesikel besitzen die einzigartige Fähigkeit, das Blutkreislaufsystem zu durchqueren, wodurch sie entfernte anatomische Stellen erreichen können. Dieses komplexe Zusammenspiel orchestriert einen molekularen Dialog, der letztendlich das Terrain für die bevorstehende Tumormetastase vorbereitet.

Wenn aus Krebszellen stammende Exosomen in Mäuse injiziert werden, neigen diese Exosomen dazu, sich in den Organen anzusammeln, in denen Krebszellen dazu neigen, zu metastasieren. Darüber hinaus können diese organspezifischen Exosomen mit verschiedenen Zelltypen interagieren. Zum Beispiel haften Exosomen, die auf die Lunge abzielen, an Endothelzellen in der Lunge, während diejenigen, die auf die Leber abzielen, in Kupffer-Immunzellen eindringen. Die Injektion von aus Krebszellen stammenden Exosomen in dieselbe Zelllinie bestätigt, dass Exosomen die organspezifische Tumormetastasierung erleichtern.

Forscher haben auch eine interessante Entdeckung gemacht – Exosomen von Brustkrebszellen, die typischerweise in die Lunge metastasieren, können eine andere Art von Tumorzelle umleiten, die normalerweise in die Knochen wandert, sodass sie in die Lunge metastasiert. Diese Erkenntnis unterstreicht weiter, dass die Eigenschaften der Tumorzellmetastasen nicht autonom sind, sondern von externen Faktoren beeinflusst werden.

Die Forscher lieferten mehrere Hinweise darauf, wie Exosomen die organspezifische Metastasierung beeinflussen. Sie fanden heraus, dass Exosomen, die auf verschiedene Organe abzielen, unterschiedliche Zelladhäsionsrezeptorproteine, insbesondere Integrine, auf ihrer Oberfläche besitzen. Verschiedene Typen von Exosomen zeigen eine Präferenz dafür, in Organe einzudringen, die eine beträchtliche Anzahl von Liganden aufweisen, die ihren Oberflächenintegrinen entsprechen. Zum Beispiel leitet das αVβ5-Integrin Exosomen zur Leber, während das α6β4-Integrin sie zu den Lungen leitet. Darüber hinaus kann die Hemmung der Expression von Exosomen oder Integrinen die Krebsmetastasierung hemmen. Schließlich lösen Exosomen, wenn sie das Zielorgan infiltrieren, die Synthese von S100-Proteinen aus, fördern Entzündungen und Zellmigration und aktivieren Src-Proteine – all dies legt die Grundlage für die Metastasierung von Krebszellen.

Vorhandensein von zirkulärer RNA in Exosomen

Zirkuläre RNA (circRNA) ist ein ubiquitäres und außergewöhnlich stabiles RNA-Molekül mit erheblicher regulatorischer Bedeutung in der Genexpression von Säugetieren. Gleichzeitig haben Exosomen, winzige Membranvesikel, die aus endozytischen Prozessen stammen, als Forschungsgegenstand erhebliches Interesse geweckt. In einer bahnbrechenden Untersuchung, die kürzlich von dem Forschungsteam unter der Leitung von Shenglin Huang und Xianghuo He am Institut für Onkologie der Fudan-Universität durchgeführt wurde, kam eine interessante Erkenntnis ans Licht. Diese Studie enthüllte eine Fülle von circRNAs innerhalb von Exosomen, ein zuvor nicht erkanntes Phänomen. Die bemerkenswerten Ergebnisse dieses Forschungsprojekts wurden in der Zeitschrift Cell Research veröffentlicht.

Das Forschungsteam extrahierte totale RNA (ohne ribosomale RNA) von sowohl MHCC-LM3-Leberkrebszellen als auch Exosomen, die aus diesen Zellen stammen. Sie führten durch RNA-Seq-Analyse und festgestellt, dass die circRNAs in Exosomen viel zahlreicher sind als die in den Quellzellen.

A: Das Circos-Diagramm zeigt circRNA in Zellen und zellabgeleiteten Exosomen; D: Das Verhältnis von circRNA zu linearer RNA ist in Exosomen sechs Mal höher als in Zellen. E: Nach der Transfektion von HEK293T-Zellen mit miR-7-Mimiksen wurden die Spiegel von CDR1as sowohl in den Zellen als auch in den zellabgeleiteten Exosomen bewertet.

Forscher bezeichnen die in Exosomen vorhandene circRNA als exo-circRNA. Exo-circRNA ist mehr als doppelt so häufig wie die in den Quellzellen gefundene circRNA. Darüber hinaus übersteigt die circRNA, die in Exosomen gelangt, die Menge an linearer RNA.

Frühere Forschungen haben bereits die Fähigkeit von zirkulären RNAs (circRNAs) gezeigt, mit miRNAs zu interagieren. Angesichts der Fülle von miRNAs in Exosomen vertieften die Forscher das komplexe Verhältnis zwischen circRNAs und miRNAs. Insbesondere konzentrierten sie sich auf CDR1as, das als Schwamm für miR-7 anerkannt ist. Um diese Beziehung zu untersuchen, wurden miR-7-Mimikry in HEK293T-Zellen transfiziert, und die CDR1as-Spiegel wurden sowohl in den Zellen als auch in ihren Exosomen bewertet. Bemerkenswerterweise zeigte die Studie eine erhebliche Reduktion der CDR1as-Spiegel in Exosomen nach der Transfektion mit miR-7, während der Rückgang in den Zellen marginal war. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Verpackung von circRNAs in Exosomen ein regulierter Prozess ist, der zumindest teilweise durch die Modulation der relevanten miRNA-Spiegel in den Quellzellen beeinflusst wird.

Neben zellabgeleiteten Exosomen entdeckten die Forscher auch eine signifikante Menge an intaktem und stabilem circRNA in menschlichen Serum-Exosomen. Darüber hinaus wies das circRNA in Serum-Exosomen von Patienten mit kolorektalem Krebs auffällige Unterschiede im Vergleich zu denen von gesunden Individuen auf. Exo-circRNA, die aus Tumoren stammt, hat das Potenzial, ein vielversprechender Biomarker für die Krebsdiagnose zu sein.

Exosomale Transkriptom-Sequenzierung

Exosomen enthalten hauptsächlich RNA, einschließlich nicht-kodierender RNA (kleine RNA, lncRNA, circRNA) und kodierende RNA (mRNA). Sie spielen eine entscheidende Rolle in der interzellulären Kommunikation und der Regulierung der Genexpression. Angesichts ihrer Vorteile, wie Amplifizierbarkeit und hohe Repräsentation, nimmt RNA in Exosomen eine dominierende Stellung in der Forschung zum Inhalt von Exosomen und zur funktionalen Erkundung ein. Darüber hinaus besteht kleine RNA aus verschiedenen Typen von kleine RNAseinschließlich miRNApiRNA, tsRNA, YRNA, jeweils mit unterschiedlichen Funktionen.

Unterscheidungen sind offensichtlich zwischen exosomale RNA und RNA, die aus Standardgewebeproben extrahiert wurde, was Untersuchungen zur Zusammensetzung von exosomaler RNA anregte. CD Genomics hat einen umfassenden Workflow entwickelt, der auf authentischen Proben basiert und die Isolation von Exosomen, die Extraktion von exosomaler RNA, den Aufbau von Transkriptom-Bibliotheken, die Einrichtung von miRNA-Bibliotheken und die anschließende Analyse der gewonnenen Daten umfasst.

Referenzen:

1. In-vivo-Bildgebung zeigt die phänotypische Nachahmung des metastatischen Verhaltens durch extrazelluläre Vesikel. Zelle. 2015.
2. Krebs: Organ-suchende Vesikel. Natur. 2015.
3. Zirkuläre RNA ist in Exosomen angereichert und stabil: ein vielversprechender Biomarker für die Krebsdiagnose. Zell Res. 2015.