Integration von WGBS mit RNA/ChIP-seq: Fälle für die Pflanzenentwicklung und die Bindungsdynamik von Cdx2

Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS) Technologie, mit ihrer einzigartigen Fähigkeit zur Detektion mit Einzelbasisauflösung, kann genau erfassen DNA-Methylierungsmodifikation Standorte im gesamten Genom, die hochauflösende und hochpräzise Daten zur Unterstützung der Analyse von epigenetischen Regulationsmechanismen bereitstellen. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) Die Technologie kann durch ihre hohe Quantität und Empfindlichkeit eine systematische Analyse und quantitative Charakterisierung von Genexpressionsprofilen auf Transkriptomebene ermöglichen.

Die gemeinsame Analyse-Strategie von WGBS und RNA-seq, durch die Integration von Informationen über epigenetische Modifikationen und Transkriptionsdaten, konstruiert ein übergreifendes regulatorisches Assoziationsnetzwerk von "DNA-Methylierung-Genexpression", das eine multidimensionale und systematische Forschungsperspektive für die Analyse der regulatorischen Mechanismen von Biomolekülen bietet. Dieses Technologie-Integrationsschema ist zu einem wichtigen Werkzeug in der Spitzenforschung der Lebenswissenschaften geworden und hat bemerkenswerten Anwendungswert und Forschungspotenzial in den Bereichen der Analyse von Tumorheterogenität und der Forschung zu Mechanismen der Pflanzenstressreaktion gezeigt.

In diesem Papier werden WGBS in Kombination mit RNA-seq und ChIP-seq In der Offenlegung des epigenetischen Regulationsmechanismus wurde dies anhand von zwei Fällen erläutert: AtSAMS reguliert die Entwicklung der Blütenorgane von Arabidopsis thaliana und die dynamische Kombination von Cdx2 in der Entwicklung und im Gleichgewichtszustand.

Enthülle den epigenetischen Mechanismus von AtSAMS, der Pflanzen reguliert.

Titel: AtSAMS reguliert die Entwicklung von Blütenorganen durch DNA-Methylierung und das Ethylen-Signalweg

Veröffentlichen Sie Magazin: Pflanzenwissenschaften

Einflussfaktoren: 4,2

Veröffentlichungsdatum: 03.07.2023

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Das Blumenorgan ist die Schlüsselstruktur der Pflanzenreproduktion, und seine Entwicklung wird streng durch die Vererbung kontrolliert. Das ABC-Modell ist eine klassische Theorie zur Erklärung der Entwicklung von Blumenorganen, in der die funktionalen Gene A, B, C und E die Bildung von Kelchblättern, Blütenblättern, Staubblättern und Fruchtblättern jeweils regulieren. Der Mechanismus der Expressionsregulation dieser Gene ist jedoch nicht vollständig klar. Als wichtige epigenetische Modifikation spielt die DNA-Methylierung eine Schlüsselrolle bei der Genregulation, der Genomstabilität und der Pflanzenentwicklung. S-Adenosylmethionin-Synthase (SAMS) ist ein Schlüsselenzym, das an der Biosynthese von S-Adenosylmethionin beteiligt ist, einem universellen Methylspender in der Methylierungsreaktion und einem gemeinsamen Vorläufer von Ethylen, Polyaminen und anderen Biosynthesen. Ethylen ist ein wichtiges Pflanzenhormon, das an vielen physiologischen Prozessen von Pflanzen beteiligt ist, einschließlich der Entwicklung von Blumenorganen. Es ist jedoch unklar, wie SAMS die Entwicklung von Blumenorganen durch Methylierung und Ethylen-Signalwege reguliert.

Vorgeschlagenes Arbeitsmodell für die AtSAMS-Regulierung von Blütenorganen in Arabidopsis (Hu et al., 2023)

Die Analyseergebnisse dieser Studie zeigten, dass die abnormale Entwicklung von Blütenorganen in Pflanzen mit Überexpression von AtSAMS in Arabidopsis thaliana durch DNA-Demethylierung und den Ethylen-Signalweg verursacht wurde. In SAMOE (Pflanze mit Überexpression von AtSAMS) nahm das gesamte Genom-DNA-Methylierungsniveau ab und der Ethylengehalt stieg an. Darüber hinaus ist der Transkriptionslevel des ACE-Gens stark mit seinem Methylierungsniveau korreliert, während die Herunterregulierung des b-Gens möglicherweise nicht mit der Demethylierung zusammenhängt, sondern unabhängig durch den Ethylen-Signalweg verursacht wird. Die SAMS-vermittelte Methylierung und der Ethylen-Signalweg könnten in der Entwicklung von Blütenorganen interagieren.

AtSAMS-Überexpression Führt Zu Abnormalen Blütenorganen

SAMOE-Pflanzen zeigen eine Vielzahl von Abnormalitäten der Blütenorgane, einschließlich der Umwandlung von Kelchblättern in Fruchtblätter, der Verringerung von Blütenblättern und Staubblättern usw., die den Phänotypen von ABCE-Genmutanten oder überexprimierten Stämmen ähneln.

• Das Transkriptionsniveau von AtSAMS in der überexprimierten Pflanze (SAMOE) wurde festgestellt. Aktin wurde als internes Referenzgen verwendet, und das standardisierte Niveau des Wildtyps (WT) wurde auf 1 gesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expressionsniveaus von AtSAMS in S1OE-10, S1OE-21, S2OE-5 und S2OE-6 signifikant höher waren als die in WT, was darauf hinweist, dass die Überexpression erfolgreich war.
• Der Anteil abnormaler Blütenorgane in WT, S1OE und S2OE wurde gezählt. Mehr als 40 % der Blüten in SAMOE entwickelten sich abnormal, während der Anteil in WT äußerst niedrig war, was darauf hindeutet, dass die Überexpression von AtSAMS zu abnormalen Blütenorganen führte.
• Zeigen Sie den abnormalen Phänotyp der Blütenorgane von SAMOE. Die WT-Blüte hat 4 Kelchblätter, 4 Blütenblätter, 6 Staubblätter und 1 Fruchtblatt. Die SAMOE-Blüten zeigen viele Abnormalitäten, wie sekundäre Blüten, in Fruchtblätter verwandelte Kelchblätter, erhöhte Fruchtblätter, verringerte Staubblätter der Kelchblätter, nicht vollständig fusionierte Fruchtblätter, blattähnliche Kelchblätter, in Fruchtblätter verwandelte Staubblätter und verringerte oder erhöhte Blütenblätter.
• Die Expression des ABCE-Gens in WT und SAMOE wurde mittels qRT-PCR analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Klasse-A-Gene (AP1, AP2) und die Klasse-B-Gene (AP3, PI) in SAMOE herunterreguliert waren, während die Klasse-C-Gene (AG) und die Klasse-E-Gene (SEP1, SEP2, SEP3) hochreguliert waren, was dem Genexpressionsmuster im ABCE-Modell entsprach.
• Vergleichen Sie den Gehalt an S-Adenosylmethionin (SAM) in WT und SAMOE. Der Gehalt an SAM in SAMOE war um 14,46 % (S1OE) und 13,38 % (S2OE) höher als der in WT, was darauf hinweist, dass die Überexpression von AtSAMS die Synthese von SAM erhöht hat.

Die Überexpression von AtSAMS zeigt abnormale Phänotypen der Blütenorgane in Arabidopsis (Hu et al., 2023).

Niedrige Methylierung führt zu abnormalen Blütenorganen.

Die Ergebnisse der WGBS zeigten, dass das gesamte genomische DNA-Methylierungsniveau von SAMOE-Pflanzen signifikant abnahm, insbesondere in der Umgebung von CHG- und CHH-Sequenzen, was zu abnormalen Blütenorganen führte.

• Vergleichen Sie die durchschnittlichen Methylierungsraten von CG-, CHG- und CHH-Sequenzen in WT und SAMOE. Die Methylierungsraten von CG, CHG und CHH in WT betragen 38,82 %, 20,03 % und 6,78 % respektive. Die Methylierungsraten von SAMOE in diesen drei Sequenzumgebungen sind alle signifikant gesunken, wobei S1OE um 24,17 %, 61,16 % und 29,06 % gesenkt wurde und S2OE um 18,80 %, 51,28 % und 29,79 % gesenkt wurde, was darauf hinweist, dass es eine genomweite Hypomethylierung in SAMOE gab.
• Der Expressionslevel von Genen, die an der DNA-Methylierung in SAMOE (SAMOE vs WT) beteiligt sind, wurde analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass mehrere SAM-abhängige Methyltransferase-kodierende Gene (wie AT1G24480 und AT1G67990) herunterreguliert waren, während das Methyltransferase-Inhibitor-Gen SAH7 hochreguliert war. Gleichzeitig nahm die Expression von DRM2, NRPD1, DCL1/2/3, RDR1/2, AGO6 und anderen Genen im RdDM-Weg ab, während die Expression von DNA-Demethylase-Genen (ROS1, DME) zunahm, was darauf hindeutet, dass die DNA-Hypomethylierung in SAMOE möglicherweise durch die verringerte Expression von SAM-abhängigen Methyltransferasen und RdDM-Weg-assoziierten Genen sowie die erhöhte Expression von DNA-Demethylasen verursacht wird.

Die Methylierungsrate und das Expressionsniveau von Genen, die an der DNA-Methylierung von SAMOE beteiligt sind (Hu et al., 2023)

Die Methylierungsniveaus der Gene C und E haben sich verändert.

Die Ergebnisse von WGBS und McrBC-qPCR zeigten, dass die Veränderungen der Methylierungslevels der funktionalen Gene A, C und E signifikant mit ihren Expressionslevels verbunden waren, während die Veränderungen in der Expression der funktionalen Gene B nichts mit der Methylierung zu tun hatten.

• Der Phänotyp der Blütenorgane in WT-Pflanzen, die mit 20 mM DNA-Methylierungsinhibitor 5'-Aza behandelt wurden. Im Vergleich zur Kontrolle (Mock) zeigten die mit 5'-Aza behandelten Pflanzen Zwergwuchs, verdrehte Blätter, erhöhte Rosettenblätter, gruppierte Stängel und andere Phänotypen. Auch die Blütenorgane wiesen ähnliche Abnormalitäten wie SAMOE auf, wie eine verringerte Anzahl von Blütenblättern, Kelchblättern und Staubblättern, 6 Blütenblätter, nicht verwachsene Fruchtblätter und sekundäre Blüten, was darauf hindeutet, dass DNA-Demethylierung zu abnormalen Blütenorganen führen kann.
• Der Methylierungsgrad der Promotorregion des ABCE-Gens nach der Behandlung mit 5'-Aza wurde mittels McrBC-qPCR analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Klasse-A-Gene (AP1, AP2) hypermethyliert waren, während die Klasse-C-Gene (AG) und die Klasse-E-Gene (SEP1, SEP2, SEP3) hypomethyliert waren, was mit den Ergebnissen der WGBS übereinstimmte.
• qRT-PCR wurde verwendet, um die Expression des ABCE-Gens in Blütenständen zu analysieren, die mit Mock und 5'-Aza behandelt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Klasse A und Klasse B Gene herunterreguliert waren, während die Klasse C und Klasse E Gene hochreguliert waren, was mit dem Expressionsmuster in SAMOE übereinstimmte und weiter darauf hinwies, dass die DNA-Demethylierung zu abnormalen Blütenorganen führte, indem sie die Expression des ABCE-Gens veränderte.

Auswirkungen der DNA-Demethylierung auf die Blütenorgane von Arabidopsis (Hu et al., 2023)

Änderungen im ABCE-Genexpressionsniveau in SAMOE-Pflanzen

Die Ergebnisse von RNA-seq und qRT-PCR zeigten, dass die Expressionsniveaus der funktionalen Gene A (AP1 und AP2) und B (AP3 und PI) herunterreguliert waren, während die Expressionsniveaus der funktionalen Gene C (AG) und E (SEP1, SEP2 und SEP3) hochreguliert waren.

• Der Methylierungsgrad des ABCE-Gens wurde in WT und SAMOE anhand von WGBS-seq-Daten verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass Klasse-A-Gene (AP1, AP2) hypermethylisiert waren, Klasse-C-Gene (AG) und Klasse-E-Gene (SEP1, SEP3) in SAMOE hypomethylisiert waren, während der Methylierungsgrad der Klasse-B-Gene (AP3, PI) unverändert blieb.
• McrBC-qPCR wurde verwendet, um den Methylierungsgrad der Promotorregion des ABCE-Gens in WT und SAMOE zu analysieren. Die Ergebnisse stimmen mit WGBS-seq überein, wobei AP1 und AP2 hypermethylisiert und AG, SEP1 und SEP3 hypomethylisiert sind.
• Thermogram der differentiell exprimierten Gene (DEGs) in WT und SAMOE. Die Ergebnisse zeigten, dass der Expressionslevel der meisten Gene in SAMOE niedriger war als der von WT, darunter 2027 Gene (um 72,2% herunterreguliert) in S1OE und 1040 Gene (um 67% herunterreguliert) in S2OE, was darauf hinweist, dass eine globale Herunterregulierung der Genexpression in SAMOE vorlag.
• Analysieren Sie das Expressionsniveau des ABCE-Gens in SAMOE. AP1, AP2, AP3 und PI waren herunterreguliert, während AG, SEP1, SEP2 und SEP3 hochreguliert waren, was mit den Ergebnissen der qRT-PCR übereinstimmte und darauf hindeutet, dass die Expressionsänderungen des ABCE-Gens mit dem Methylierungsniveau (ACE-Gen) oder nicht (B-Gen) zusammenhingen.

Die Methylierung und der Expressionslevel der ABCE-Gene in SAMOE (Hu et al., 2023)

WGBS in Kombination mit ChIP-seq Enthüllt den Dynamischen Bindungsmechanismus von Cdx2

Titel: Motivverteilung und DNA-Methylierung bestimmen die unterschiedliche Cdx2-Bindung während der Entwicklung und Homöostase

Veröffentlichung Magazin: Nature Communications

Impact Faktoren: 16,6

Veröffentlichungsdatum: 22.01.2025

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Cdx2 ist ein Schlüsseltranskriptionsfaktor und spielt eine entscheidende Rolle in der Entwicklung von intestinalen Epithelzellen bei Mäusen. Er wird sowohl in embryonalen als auch in adulten intestinalen Epithelzellen exprimiert, aber seine Bindungsstellen im Genom sind in der Entwicklung und im Erwachsenenalter unterschiedlich. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die normalerweise mit der Genstilllegung assoziiert ist. Einige Transkriptionsfaktoren (wie Cdx2) könnten jedoch eher geneigt sein, an methylierte DNA-Sequenzen zu binden. Transkriptionsfaktoren leiten die Gewebeentwicklung, indem sie entwicklungsstadiums-spezifische Ziele kombinieren und eine geeignete Enhancer-Landschaft etablieren. DNA-Sequenz und Chromatinmodifikation werden die genomische Bindung von Transkriptionsfaktoren leiten. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie Transkriptionsfaktoren chromosomale Merkmale navigieren, um selektiv an eine kleine Teilmenge aller möglichen genomischen Zielorte zu binden.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass Cdx2, als ein genealogie-bestimmender Transkriptionsfaktor, der verschiedene Ziele in sich entwickelnden intestinalen Epithelzellen und adulten intestinalen Epithelzellen bindet, eine bevorzugte Affinität für ein atypisches Motiv mit CpG in vivo hat. Die hohe Häufigkeit von Motiven in embryonalen Cdx2-Zielen und der Methylierungszustand von CpG während der Entwicklung ermöglichen es Cdx2, selektiv Entwicklungs-Enhancer und Gene zu binden und zu aktivieren.

Dynamische Veränderungen der Cdx2-Bindungsstellen

Es gibt signifikante Unterschiede in den Bindungsstellen von Cdx2 zwischen embryonalen (E12.5 und E16.5) und adulten Maus-Darmepithelzellen. Im embryonalen Stadium waren die Bindungsstellen hauptsächlich im Promotorbereich verteilt (24 %), während sie im adulten Stadium überwiegend im Enhancerbereich verteilt waren (> 87 %). Diese Änderung des Bindungsmodus von Promotor zu Enhancer spiegelt die funktionalen Veränderungen von Cdx2 in verschiedenen Entwicklungsstadien wider. Cdx2 aktiviert Schlüsselentwicklungsgen (wie Sox4 und Meis1), indem es im embryonalen Stadium an Promotorregionen bindet, und erhält die Gleichgewichtsfunktion von Geweben (wie Krt19 und Fabp2), indem es im adulten Stadium an Enhancerregionen bindet.

Die Evolution der Cdx2-Bindung an Gen-Promotoren und Enhancern unterstützt die Entwicklungs- und Homöostasefunktionen im intestinalen Epithel (Lorzadeh et al., 2025)

Cdx2-Bindungsmotiv-Präferenz

Cdx2 neigt dazu, atypische Motive (ATAAA+CpG) zu binden, die CpG in der embryonalen Phase enthalten, während es dazu neigt, klassische Motive ohne CpG in der Erwachsenenphase zu binden. Diese Motivpräferenz ermöglicht es Cdx2, selektiv an verschiedenen genomischen Stellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien zu binden. Das von Cdx2 gebundene CpG enthält ein Motiv, das in der embryonalen Phase normalerweise methyliert ist, was die Bindung von Cdx2 und die Genaktivierung fördert. Im Erwachsenenalter verhinderte die Demethylierung dieser Stellen die Bindung von Cdx2 und vermied so eine ektopische Bindung.

Erhöhte Präsenz von CpG-haltigen Cdx2-Motiven an seinen Entwicklungsbindungsstellen (Lorzadeh et al., 2025)

Synergistischer Effekt der Cdx2-Bindung und Chromatinmodifikation

Cdx2 kann Ctcf und Hnf4a an verschiedene genomische Stellen rekrutieren, indem es unterschiedliche Motive kombiniert. Im embryonalen Stadium rekrutiert Cdx2 Ctcf, indem es das CpG-Motiv kombiniert, um Super-Enhancer zu bilden, die entwicklungsspezifische Gene aktivieren. Im Erwachsenenalter rekrutiert Cdx2 Hnf4a, indem es klassische Motive kombiniert, um homöostatische Enhancer zu bilden, die die Gewebefunktion aufrechterhalten. Die Bindungsstelle von Cdx2 hat im embryonalen Stadium normalerweise eine hohe Chromatinzugänglichkeit, aber im Erwachsenenalter ist es notwendig, den Chromatinzustand durch Demethylierung und andere Mechanismen zu regulieren, um die Genexpressionsregulation zu realisieren.

cdx2 erleichtert die Etablierung von adulten homöostatischen Super-Enhancern, indem es die Rekrutierung von Ctcf lenkt (Lorzadeh et al., 2025)

Einfluss der DNA-Methylierung auf die Cdx2-Bindung

Durch die Veränderung der DNA-Methylierung, die durch das Knockout des Eed-Gens oder den Inhibitor GSK-3484862 induziert wird, wurde festgestellt, dass diese Veränderung Cdx2 erneut an die Zielstelle der Entwicklungsstufe rekrutieren kann, wodurch die Genexpression in der Entwicklungsstufe aktiviert wird. Im Erwachsenenalter kann Cdx2 durch die Induktion der DNA-Methylierung an der Zielstelle der Entwicklung rekombinieren, was darauf hinweist, dass die Bindung von Cdx2 durch DNA-Methylierung reguliert wird. Diese methylierungsabhängige Bindung ermöglicht es Cdx2, die Genexpression zu regulieren, indem es an verschiedenen genomischen Stellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und unter stabilen Bedingungen bindet.

Der Verlust der PRC2-Aktivität führt zu einem Anstieg der DNA-Methylierung an Enhancern, was zur Rekrutierung von Cdx2 führt (Lorzadeh et al., 2025).

Fazit

Die Kombination von WGBS mit ChIP-seq und RNA-seq kann das regulatorische Netzwerk der Genexpression aus mehreren Dimensionen analysieren. WGBS kann DNA-Methylierungsmuster aufdecken, ChIP-seq kann Protein-DNA-Interaktionsstellen wie Histonmodifikationen lokalisieren, und RNA-seq zeigt die Dynamik des Transkriptoms. Durch die kombinierte Anwendung kann die Beziehung zwischen epigenetischer Modifikation, Chromatinzustand und Genexpression hergestellt werden, und der Mechanismus der epigenetischen Regulation kann weiter erklärt werden. Diese kombinierte Technologie hat sich in der Forschung zu Entwicklung, Krankheiten usw. etabliert. In Zukunft wird die Integration mit der Einzelzelltechnologie die Entwicklung der Forschung zur offensichtlichen Regulation in eine höhere Auflösung und dynamischere Richtung vorantreiben und einen neuen Weg für die Lebenswissenschaften eröffnen.

Referenzen:

1. Hu W, Hu S, Li S, et al. "AtSAMS reguliert die Entwicklung von Blütenorganen durch DNA-Methylierung und den Ethylen-Signalweg." Pflanzenwissenschaften. 2023 334: 111767 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Wenn Sie den Text hier eingeben, helfe ich Ihnen gerne bei der Übersetzung.
2. Lorzadeh A, Ye G, Sharma S, Jadhav U. "Motivverteilung und DNA-Methylierung liegen einer unterschiedlichen Cdx2-Bindung während der Entwicklung und Homöostase zugrunde." Nat Commun2025 16(1): 929 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.