Prinzipien und Arbeitsablauf der Whole Genome Bisulfit-Sequenzierung

Einführung in WGBS

In typischen Forschungsszenarien bezieht sich die DNA-Methylierung überwiegend auf einen Methylierungsprozess, der am 5. Kohlenstoffatom von Cytosin in CpG-Dinukleotiden auftritt, was zur Bildung von 5-Methylcytosin (5-mC) führt. Dies stellt die Hauptform der DNA-Methylierung in Eukaryoten, einschließlich Pflanzen und Tieren, dar und ist die einzige Form bei Säugetieren. Angesichts der relativen Stabilität der DNA-Methylierung als Modifikationsstatus kann sie durch den DNA-Replikationsprozess an die Nachkommendna vererbt werden, was einen bedeutenden Mechanismus der epigenetischen Vererbung darstellt.

Daher hat die Verteilung von 5-Methylcytosin (oder Methylom) über das gesamte Genom beträchtliche Aufmerksamkeit erregt. Whole Genome Bisulfite-Sequenzierung (WGBS) ist eine Methode, die eine Bisulfitbehandlung nutzt, um unmethylierte Cytosine (C) im Genom zu konvertieren, wodurch methylierte von unmethylieren Cytosinen unterschieden werden, gekoppelt mit Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie, um den Methylierungsstatus an CpG/CHG/CHH-Stellen zu bestimmen. Sie wurde erfolgreich in der Methylom-Analyse über verschiedene Zweige der eukaryotischen Phylogenie, mehrere Arten und in der Analyse von Methylomen in menschlichen embryonalen Stammzellen, induzierten pluripotenten Stammzellen, peripheren mononukleären Blutzellen, Dickdarmkrebszellen und anderen angewendet. Diese WGBS Datensätze haben zahlreiche Entdeckungen hervorgebracht, die mit anderen Methoden nicht zugänglich sind. Mit den sinkenden Kosten für die Sequenzierung wird WGBS zunehmend zur bevorzugten Methode in der Forschung. Traditionelle WGBS Methoden stellen erhebliche Herausforderungen für Proben mit niedrigem Input dar. Da die Anwendungen der Methylierungsanalyse weiterhin zunehmen, von Studien zur embryonalen Entwicklung bis hin zu klinischen Anwendungen wie der frühen Tumorscreening, wächst die Nachfrage nach der Konstruktion von Methylierungsbibliotheken aus Proben mit niedrigem Input.

Prinzipien der WGBS

Epigenetische Studien haben bestätigt, dass die DNA-Methylierungsmodifikation bestimmter Genregionen eine wichtige Rolle bei der Chromosomenkonformation und der Regulierung der Genexpression spielt. Die Methylierung von DNA-Cytosin-Resten an der C5-Position (5^michC) ist ein häufiges epigenetisches Merkmal in vielen Eukaryoten und wird weit verbreitet in CpG oder CpHpG (H=A, T, C) gefunden. Es gibt hauptsächlich drei Ansätze, einschließlich Endonuklease-Digestion, Affinitätsanreicherung und Bisulfid-Konversion (Tabelle 1). Fast alle sequenzspezifischen DNA-Methylierungsanalyseansätze erfordern eine methylierungsabhängige Behandlung vor der Amplifikation oder Hybridisierung, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Verschiedene molekularbiologische Techniken, wie Next-Generation Sequencing (NGS), werden anschließend durchgeführt, um 5^michC-Rückstände.

Tabelle 1. Hauptprinzipien der NGS-basierten Methylierungsanalyse.

*MCA: amplifizierte methylierten CpG-Inseln; *HELP: HpaII winzige Fragmentanreicherung durch ligationsvermittelte PCR; *MSCC: zählende Analyse methylierungsempfindlicher Schnitte; *MeDIP-seqmethylierte DNA-Immunpräzipitation; *MIRA: Assay zur Rückgewinnung methylierter CpG-Inseln; *RRBSreduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung; *WGBS: Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung; *BSPP: Bisulfid-Padlock-Sonden.

Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die DNA-Methylierungsniveaus in Proben zu bewerten. Die Bisulfit-Konversion löste in den 1990er Jahren eine Revolution in der Analyse der Genom-Methylierung aus. Sie gilt als der "Goldstandard" zur Bestimmung des Methylierungsniveaus, WGBS Funktionen basierend auf der Bisulfid-gestützten Methylierungsanalyse. Diese Technik beginnt mit der Behandlung von DNA-Proben mit Bisulfid, das erfolgreich unmethyliertes Cytosin in Uracil umwandelt, während methyliertes Cytosin unbeeinflusst bleibt. Die anschließende PCR-Amplifikation führt dazu, dass Uracil in Thymin umgewandelt wird, wodurch es sich von den ursprünglichen methylierten Cytosinen unterscheidet. In Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie ermöglicht diese Methode die Kartierung eines vollständigen DNA-Methylierungsprofils des Genoms mit einer Auflösung auf Einzelbasenebene.

Abbildung 1. Bisulfitumwandlung und PCR-Amplifikation vor der DNA-Sequenzierung.

WGBS ist eine hochauflösende Sequenzierungstechnologie, die eingesetzt wird, um den Methylierungsstatus von Cytosinbasen in DNA-Molekülen zu erkennen. Im Rahmen von WGBS wird die DNA-Probe zunächst einer Bisulfidbehandlung unterzogen, wodurch nicht-methylierte Cytosine in Uracil umgewandelt werden, während die methylierte Cytosine unverändert bleiben. Durch die Sequenzierungsanalyse können wir den Methylierungsstatus jeder Cytosinbase bestimmen. WGBS, als Forschungsmethode von großer Bedeutung in diesem Bereich, wendet eine Kombination aus Bisulfitbehandlung und Next-/Third-Generation-Sequenzierungstechnologien (hauptsächlich Shotgun-Sequenzierung) an, um die DNA-Methylierung auf genomischer Ebene zu untersuchen.

Workflow von WGBS

Kurz gesagt, die grundlegenden Schritte von WGBS einschließlich DNA-Extraktion, Bisulfit-Konversion, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und bioinformatischer Analyse. Hier verwenden wir Illumina HiSeq als unser Beispiel, um den Arbeitsablauf von WGBS zu veranschaulichen.

Abbildung 2. Der Arbeitsablauf der gesamten Genom-Bisulfid-Sequenzierung.

Abbildung 3. Der Arbeitsablauf der Whole-Genome-Bisulfite-Sequenzierung (Khanna et al. 2013).

• DNA-Extraktion

Zunächst werden etwa 1-5 mg Gewebeproben, die von Menschen, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen gesammelt wurden, zur DNA-Vorbereitung aufbereitet. Im Allgemeinen müssen Proben für die Ganzgenom-Bisulfid-Sequenzierung die folgenden vier Merkmale erfüllen.

e. Eukaryoten;

ii. Hypomethylierung (wie in Abbildung 4 gezeigt, haben Studien gezeigt, dass, sobald die Anzahl der CpG-Stellen in einem Bereich zunimmt, die Sequenzierungsdaten von WGBS zu sinken beginnen);

iii. Sein Referenzgenom wurde mindestens auf Scaffold-Ebene assembliert;

iv. Relativ vollständige Genomannotationen. Anschließend ein geeignetes Kit anwenden, um hochreines und hochmolekulares DNA zu extrahieren. Die extrahierte DNA sollte eine Masse von mindestens 5 μg, eine Konzentration von mindestens 50 ng/μl und ein OD260/280 von 1,8 bis 2,0 aufweisen.

Abbildung 4. Die konventionelle WGBS-Technologie hat eine geringe Abdeckung von Methylierungsstellen (Raine et al., 2016)

• Bisulfit-Konversion

Die Bisulfit-Konversion gilt als der "Goldstandard" für die DNA-Methylierungsanalyse, die Prinzipien sind in Abbildung 5 dargestellt. Bei dieser Methode kann die durch BS induzierte DNA-Degradation zu einer Depletion von genomischen Regionen führen, die reich an unmethylierten Cytosinen sind. Daher ist es wichtig, die Menge der DNA-Degradation unter den Reaktionsbedingungen zu bewerten, und wie sich dies auf das gewünschte Amplicon auswirkt, sollte ebenfalls berücksichtigt werden. Olova et al. (2018) fanden heraus, dass die DNA-Degradation in Bisulfit-Konversionsprotokollen, die eine hohe Denaturierung oder hohe Bisulfit-Molarität verwenden, stark ist. Es sind mehrere Kits auf dem Markt erhältlich (Tabelle 2).

Abbildung 5. Bisulfit-vermittelte Deaminierung von Cytosin (Hayatsu et al. 2004).

Tabelle 2. Bisulfit-Konversionsprotokolle und -parameter.

• Bibliotheksvorbereitung

Nehmen Sie das EpiGnome™ Methyl-Seq Kit (Epicentre) als Beispiel (wie in Abbildung 6 gezeigt), wird einzelsträngige DNA, die mit Bisulfit behandelt wurde, zufällig mit Primern versehen, wobei eine Polymerase verwendet wird, die in der Lage ist, Uracil-Nukleotide zu lesen, um DNA mit einem spezifischen Sequenz-Tag zu synthetisieren. Das 3'-Ende des neu synthetisierten DNA-Strangs wird dann selektiv mit einer zweiten spezifischen Sequenz markiert, sodass ein DNA-Molekül mit zwei Markern und einem bekannten Sequenz-Tag an den 5'- und 3'-Enden erhalten werden kann. Illumina P7- und P5-Adapter werden anschließend durch PCR an den 5'- und 3'-Enden vor der DNA-Sequenzierung hinzugefügt.

Abbildung 6. Arbeitsablauf für das EpiGnome™ Methyl-Seq Kit.

• Sequenzierung

Die Hiseq-Sequenzierungstechnologie, eine neuartige Sequenzierungsmethode, die auf Sequenzierung durch Synthese (SBS) basiert, wird weit verbreitet angewendet für WGBSDie Brückenverstärkung auf einer Flusszelle wird durch die Verwendung eines Einzelmolekül-Arrays erreicht. Da die neue reversible Blockiertechnik nur eine Base gleichzeitig synthetisieren und den Fluorophor markieren kann, wird der entsprechende Laser verwendet, um den Fluorophor zu erregen, und das Erregungslicht kann erfasst werden, um die Basisinformationen auszulesen. Die Paired-end 150 bp-Strategie wird typischerweise in der WGBS verwendet, um 250-300 bp große bisulfit-behandelte DNA-Bibliotheken zu sequenzieren. Neben Illumina HiSeq, PacBio SMRT, NanoporeRoche 454 und andere Illumina-Plattformen werden ebenfalls häufig für diesen Zweck verwendet.

• Datenanalyse

Eine Reihe von Analysen kann für die Sequenzierungsergebnisse durchgeführt werden. Fünf Haupttypen der Informationsanalyse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Darüber hinaus können auch Analysen der Methylierungsdichte, Analysen von unterschiedlich methylierten Regionen (DMR), DMR-Anmerkungen und Anreicherungsanalysen (GO/KEGG) sowie Clusteranalysen durchgeführt werden. Die gängigen bioinformatischen Ressourcen von WGBS einschließlich BDPC, CpGcluster, CpGFinder, Epinexus, MethTools, mPod, QUMA und TCGA-Datenportal.

Tabelle 3. Haupttypen der WGBS-Datenanalyse.

Vorteile und Einschränkungen von WGBS

Vorteile:

• Einzelbasenauflösung: Die Methode ermöglicht eine präzise Analyse bis hin zur Einzelbasenauflösung, wodurch eine genaue Bestimmung des Methylierungsstatus jeder Cytosinbase möglich ist. Sie gilt als der "Goldstandard" in der Forschung zum Methylierungsniveau.
• Hohe Umwandlungsrate bei der Methylierungsbibliothekskonstruktion: Die durchschnittliche Umwandlungsrate durch Bisulfit-Sequenzierung liegt über 99%, mit strengen Qualitätskontrollmaßnahmen während der Bibliothekskonstruktion.
• Breites Anwendungsgebiet: Die Methode ist auf Methylierungsforschung bei allen Arten mit bekannten Referenzgenomen anwendbar.
• Vollständige Genomabdeckung: Sie maximiert den Erwerb umfassender Informationen zur Methylierung des vollständigen Genoms und ermöglicht eine präzise Kartierung der Methylierungslandschaft.
• Epigenomisch Forschung: Es birgt ein erhebliches Potenzial für das Studium der spatiotemporalen Spezifität im Bereich der Epigenetik.

Einschränkungen:

• Großes Datenvolumen erforderlich (mindestens 30-fache Abdeckung empfohlen).
• Abhängigkeit von einem Referenzgenom.
• Erhöhte AT-Baseninhalte nach der Behandlung, die Sequenzierung und Analyse beeinflussen können.
• Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schäden während der Bisulfitbehandlung.

Anwendungen von WGBS

(1) Epigenetische Studien: WGBS dient als ein instrumentelles Werkzeug zur Untersuchung von Variationen der DNA-Methylierung zwischen verschiedenen Zelltypen, Geweben oder Entwicklungsstadien und enthüllt damit die Rolle epigenetischer Veränderungen innerhalb biologischer Prozesse. Dies verbessert unser Verständnis der Mechanismen, die an der Regulierung der Genexpression, der Zell-Differenzierung, der Entwicklung und dem Auftreten von Krankheiten beteiligt sind.

(2) Krankheitsforschung: Bei der Erforschung von Krankheiten, WGBS spielt eine entscheidende Rolle. Forscher können die DNA-Methylierungsmuster in gesunden und krankheitsbetroffenen Zuständen vergleichen, um Methylierungsveränderungen zu identifizieren, die mit dem Beginn und dem Fortschreiten von Krankheiten in Zusammenhang stehen. Solche Untersuchungen sind von großer Bedeutung für Studien zu Krebs, neurologischen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderen.

(3) Individuelle Unterschiede und PopulationsgenetikWGBS erleichtert auch die Forschung zu interindividuellen DNA-Methylierungsvariationen und trägt dazu bei, das genetische Variationsmuster der Methylierung innerhalb von Populationen zu verstehen. Dies fördert die Analyse der genetischen Grundlagen der Methylierung sowie deren Rolle bei der Bestimmung der gesundheitlichen Anfälligkeit eines Individuums.

(4) Umweltverträglichkeitsstudien: Externe Umweltfaktoren wie Ernährung, Toxine, Medikamente usw. können potenziell die DNA-Methylierung beeinflussen. WGBS unterstützt Forscher dabei, zu bewerten, wie diese Umweltkräfte die Genexpression durch Methylierung modifizieren könnten, wodurch die physiologische Funktionalität und das Krankheitsrisiko eines Individuums beeinflusst werden.

(5) evolutionär Forschung: Darüber hinaus kann WGBS verwendet werden, um DNA-Methylierungsmuster zwischen verschiedenen Arten zu vergleichen, was Aufschluss über die Rolle der Methylierung in der Evolution gibt. Dies kann unser Verständnis darüber erweitern, wie Methylierung zur Anpassung von Arten und zur Entstehung von Vielfalt beiträgt.

Unterschied zwischen WGBS und RRBS

WGBS ist eine Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie, die für die DNA-Methylierungsanalyse verwendet wird. Sie kann eine Methylierungsanalyse des gesamten Genoms durchführen, wobei jede Cytosin-Basis abgedeckt und ihr Methylierungsstatus identifiziert wird, wodurch WGBS zum Goldstandard für die DNA-Methylierungsforschung wird, der in der Lage ist, hochauflösende und umfassende Methylierungsinformationen bereitzustellen. Reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung (RRBS) ist eine 'reduzierte Repräsentation' Methylierungssequenzierungsmethode, die gezielt bestimmte Bereiche im Genom sequenziert, die reich an CpG-Inseln und anderen hochmethylierten Regionen sind, im Gegensatz zu WGBSTrotz der engeren Abdeckung von RRBS ist es kosteneffektiver und besser geeignet für großangelegte Studien, da es eine geringere Sequenzierungstiefe erfordert.

Eine eingehende vergleichende Analyse zwischen Whole Genome Bisulfite-Sequenzierung (WGBS) und die reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung (RRBS) kann deren jeweilige Stärken und Schwächen aufzeigen, was Forschern hilft, den optimalen Ansatz auszuwählen, der mit ihren Forschungszielen übereinstimmt. Sollte beispielsweise ein umfassendes Verständnis des Methylierungsstatus jeder Cytosin-Basis im Genom für die Studie erforderlich sein, WGBS könnte eine überlegene Wahl sein. Im Gegensatz dazu, wenn die Forschung bestimmte Methylierungsregionen betont oder die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben erfordert, könnte RRBS potenziell eine kostengünstigere Lösung bieten. Darüber hinaus kann der Vergleich dieser beiden Techniken zu einer besseren Bewertung ihrer Leistung und Anwendbarkeit beitragen. Durch den Gegensatz WGBS und RRBS in Bezug auf Datenvolumen, Kosten, Abdeckung, Auflösung usw. können Forscher ein umfassenderes Verständnis der Vor- und Nachteile jeder Methode gewinnen. Dieses Wissen kann wiederum das experimentelle Design und die Datenanalyse auf eine aufschlussreichere Weise leiten.

Tabelle 4. Unterschied zwischen WGBS und RRBS

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