Übersicht über gezielte Sequenzierung

Was ist gezielte Sequenzierung?

Gezielte Sequenzierung (tNGS) beinhaltet die präzise Anreicherung spezifischer Regionen oder Loci innerhalb des Genoms, gefolgt von der Sequenzierung mit Methoden der nächsten Generation wie der Next-Generation-Sequenzierung. Dazu gehören Techniken wie die gesamte Exomsequenzierung, die sich auf die protein-codierenden Regionen des Genoms konzentriert, sowie maßgeschneiderte Sequenzierungs-Panels, die für die Untersuchung bestimmter Gene von Interesse entwickelt wurden.

Empfohlene Lektüre: WGS vs. WES vs. gezielte Sequenzierungs-Panels.

Geschichte der gezielten Sequenzierung

Der Beginn der Genomsequenzierung in der Lebenswissenschaftsforschung geht auf entscheidende Momente in der Wissenschaftsgeschichte zurück:

Im Jahr 1977 entwickelten Walter Gilbert und Frederick Sanger den ersten Sequenzierer und verwendeten die Kettenabbruch-Sequenzierung, um die Genomsequenz des Phagen X174 zu entschlüsseln, die 5.375 Basen umfasste. Dieser Durchbruch markierte den offiziellen Beginn der Gen-Sequenzierung in der wissenschaftlichen Forschung.

Auf dieser Grundlage führten 1988 Chambehian et al. die Multiplex-PCR-Technologie ein und legten damit den Grundstein für nachfolgende Fortschritte in den Methoden der Multiplex-PCR-Amplicon-Sequenzierung.

Ein bedeutender Meilenstein in der Evolution von gezielte Sequenzierung ereignete sich im Jahr 2005, als Nature Methods einen Artikel mit dem Titel "Direkte genomische Selektion" veröffentlichte. Dieser Ansatz nutzte 150 kb biotin-markierte BAC-DNA für die Hybridisierung mit menschlicher genomischer DNA, gefolgt von der Auffangung von DNA-Fragmenten mittels Streptavidin-Affinitätsperlen. Die anschließende PCR-Amplifikation erleichterte das Sequenzieren und zeigte, dass etwa 50 % der sequenzierten Fragmente aus dem Zielbereich stammten.

Heute verwendet das gezielte Sequenzieren überwiegend zwei Methoden: die gezielte Erfassung und die Multiplex-PCR, auch bekannt als Amplicon-Sequenzierung.

Gezielte Sequenzierung vs. Gesamte Genomsequenzierung

Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) umfasst die Sequenzierung aller Basen des gesamten Genoms und bietet ein umfassendes Profil der Sequenz des Genoms. Zu den Hauptanwendungen gehören die Genomassemblierung und die Identifizierung verschiedener genomischer Varianten, einschließlich struktureller Varianten.

Gezielte Sequenzierung (auch bekannt als Genpanel-Sequenzierung) selektiv bestimmte Gene, typischerweise im Bereich von einigen Dutzend bis zu tausend Genen, sequenziert. Daher gilt in Bezug auf die Genomabdeckung: Whole-Genome-Sequenzierung > Whole-Exome-Sequenzierung > gezielte Sequenzierung.

Die Whole-Exome-Sequenzierung kann als ein Teilbereich der gezielten Sequenzierung betrachtet werden, der sich ausschließlich auf die Sequenzierung aller Exons im Genom konzentriert.

WGS bietet den umfassendsten Erfassungsbereich, der kodierende und nicht kodierende Regionen sowie regulatorische Regionen und strukturelle Varianten umfasst. Im Vergleich zur gezielten Sequenzierung hat WGS jedoch einige Einschränkungen.

• Analyse- und Interpretationskomplexitäten ergeben sich aus der Erkennung zahlreicher Introns und intragenischer Varianten.
• Verursacht höhere Erkennungskosten im Vergleich zu WES, insbesondere bei der Sicherstellung von Datenumfang und -qualität.
• Erfordert komplexe Methoden für die Datenspeicherung, -analyse und -annotation aufgrund des gestiegenen Datenvolumens.
• Der Mangel an Referenzen für seltene Varianten in großen Stichproben könnte die Analyse der Pathogenität behindern.

Im Vergleich dazu ermöglicht das gezielte Sequenzieren eine tiefere Sequenzierung aufgrund seines kleineren Erkennungsbereichs (z. B. machen Exons nur 1 % aller menschlichen Gensequenzen aus). Dies ermöglicht die Erkennung von niedrigfrequenten und seltenen Varianten, während Kosten und Speicheranforderungen reduziert werden. Daher bietet das gezielte Sequenzieren eine kostengünstigere Lösung, insbesondere für Forschungsprojekte mit begrenzter Finanzierung und Studien, die sich auf Krankheiten mit kodierenden Proteinvarianten konzentrieren.

Methoden der DNA-Sequenzierung. (Bewicke-Copley et al., 2019)

Hybridisierungsfängende gezielte Sequenzierung

Die Hybridisierungsfängung steht als ein gezielte Sequenzierung Marvel, nahtlos molekulare Hybridisierung mit Techniken der nächsten Generation der Sequenzierung verbindend. Diese ausgeklügelte Methode basiert auf dem sorgfältigen Design und der Synthese von Sonden, die auf die Zielgenomregion zugeschnitten sind. Diese Sonden, die als molekulare Magnete fungieren, binden selektiv an die gewünschten Fragmente innerhalb der Zielregion, während überflüssige Segmente schnell entfernt werden.

• Festphasen-Hybridisierung: Diese Variante umfasst die Anbringung der Sonde an einem Festphasen-Chip, wodurch die Erfassung des Zielbereichs durch präzise Sonden-Ziel-Interaktionen erleichtert wird.
• Flüssigphasen-Hybridisierung: In dieser Iteration entfaltet sich der experimentelle Prozess in einem flüssigen Milieu. Sonden sind mit Biotin-Moieties ausgestattet, die ihre Rückgewinnung nach der Hybridisierung mittels streptavidin-beschichteter Magnetperlen ermöglichen. Nach Abschluss der Hybridisierung fangen diese Perlen selektiv die an die Sonden gebundenen Zielfragmente ein. Die anschließende Elution entfernt ungebundene Fragmente aus der Lösung, gefolgt von einer Denaturierung, um die eingefangenen Zielfragmente freizusetzen. Durch eine strategische magnetische Auffangung werden dann verbleibende ungebundene Sonden entfernt, um die Reinheit und Vollständigkeit der eingefangenen Sequenzen zu gewährleisten.

Die Hybridisierungsfängung orchestriert somit eine Symphonie molekularer Interaktionen, die in der präzisen Isolierung und Sequenzierung von Zielgenomregionen gipfelt.

Multiplex-PCR-gezielte Sequenzierung

Multiplex-PCR gezielte Sequenzierungauch als gezielte Amplicon-Sequenzierung bezeichnet, integriert nahtlos Multiplex-PCR-Technologie mit Methoden der Next-Generation-Sequenzierung. Dieser innovative Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Amplifikation mehrerer Zielregionen-Sequenzen, was zu Amplicon-Produkten führt. Anschließend werden Adaptersequenzen, die für die Next-Generation-Sequenzierung erforderlich sind, an beiden Enden der Amplicon-Produkte eingeführt, entweder durch PCR-Amplifikation oder enzymatische Ligation. Dieser Schritt verwandelt die Amplicons in Bibliotheken, die bereit für die Next-Generation-Sequenzierung sind.

Nach der Bibliotheksvorbereitung wird eine Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt, gefolgt von einer Analyse der Rohdaten. Dieser umfassende Prozess liefert Sequenzinformationen, die spezifisch für die Zielregionen sind, und erfüllt damit das Hauptziel der gezielten Sequenzierung.

• Häufige Anwendungen

Multiplex-PCR-gezielte Sequenzierung findet in verschiedenen Bereichen weit verbreitete Anwendung. Zum Beispiel im Bereich der Pathogenerkennung erleichtert diese Technik die Analyse der Gemeinschaftszusammensetzung und Verteilung von pathogenen Mikroorganismen. Solche Analysen spielen eine entscheidende Rolle bei der Diagnose klinischer pathogener Infektionen und tragen erheblich zu Krankheitsmanagement und Behandlungsstrategien bei.

Multiplex-PCR-gezielte Sequenzierung erweist sich somit als vielseitiges Werkzeug, das eine präzise Erkennung und Charakterisierung von Zielgenomregionen in verschiedenen Anwendungen ermöglicht.

Tabelle 1 Unterschiede zwischen WGS, Hybridisierungsfang-NGS-Panels und Multiplex-PCR-NGS-Panels

Bewertung von Daten für gezielte Sequenzierung

Die Qualität der aus der Erfassung des Zielgenbereichs gewonnenen Daten wird hauptsächlich anhand der folgenden Schlüsselindikatoren bewertet: Abdeckung des Zielbereichs, Erfassungseffizienz und Homogenität der Abdeckung des Zielbereichs.

• Zielregion AbdeckungDiese Kennzahl bezeichnet den Anteil der erfassten Regionen im Vergleich zur gesamten Zielregion. Idealerweise sollten alle interessierenden Regionen abgedeckt sein. Aufgrund von Überlegungen zum Probenentwurf, wie z.B. GC-Gehalt, Sequenzeigenschaften, Variationen in der Kopienzahl und Sequenzähnlichkeit, kann jedoch ein kleiner Teil der Zielregion von der Erfassung ausgeschlossen werden, typischerweise etwa 0-3 %. Im Allgemeinen deutet eine höhere Zielabdeckung auf eine bessere Leistung der Sonden oder der Multiplex-PCR hin.
• ErfassungsrateDiese Maßnahme stellt den Prozentsatz der Daten dar, die mit der Zielregion im Verhältnis zu den insgesamt erhaltenen Daten übereinstimmen. Eine höhere Erfassungs-effizienz spiegelt eine bessere Nutzung der Sequenzierungsdaten wider. Es ist entscheidend, die Sequenzeigenschaften bei der Gestaltung von Sonden zu bewerten. Sonden, die häufig an Duplikat- oder hochkopierten Sequenzregionen binden, können nicht-zielgerichtete Regionen erfassen, was die Erfassungs-effizienz verringert. Die Gestaltung spezifischerer Sonden kann das Binden an unspezifische Sequenzen verringern und somit die Erfassungs-effizienz erhöhen.

Die Bewertung dieser Parameter gewährleistet die Zuverlässigkeit und Effektivität von gezielten Sequenzierungsdaten und liefert wertvolle Einblicke in die beabsichtigten genomischen Regionen.

Gezielte Next-Generation-Sequenzierung Proben- und Datenverarbeitungsworkflow. (Gulilat et al., 2019)

Faktoren, die die Fangeffizienz beeinflussen

• Hohe GC-RegionenRegionen wie untranslatierte Regionen (UTRs) und Promotoren weisen oft einen hohen GC-Gehalt auf, was zu geringeren Erfassungs-Effizienzen führt. Diese Diskrepanz in der Erfassungs-Effizienz zwischen Regionen mit hohem GC-Gehalt und anderen kann zu ungleichmäßiger Abdeckung führen.
• DNA-QualitätDie Qualität der DNA hat einen erheblichen Einfluss auf den Erfassungsbias, der insbesondere bei Proben aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Geweben, bei denen die Fragmentierungsgrade variieren, deutlich wird. Der Einsatz von automatisierten Elektrophoresegeräten von Agilent wie dem 2100 Bioanalyzer oder dem Tapestation-Analyzer zur Qualitätskontrolle gewährleistet eine ausgewogene Erfassung und minimiert den Bias bei nachgelagerten Analysen.
• DNA-EingabemengeUnzureichende DNA-Eingabe erfordert zusätzliche PCR-Zyklen während der Bibliothekskonstruktion, was zu einer Zunahme von PCR-Duplikaten und einer Verringerung der Datennutzbarkeit führt. Fortschritte in der Technologie haben die erforderliche DNA-Eingabe von Mikrogramm auf Nanogramm für gezielte Sequenzierung reduziert.
• PseudogeneDie Anwesenheit von Pseudogenen kann die Gleichmäßigkeit der Abdeckung stören und die Datengenauigkeit beeinträchtigen.
• DNA-FragmentgrößeDie optimale Anpassung der Fragmentgröße an das Proben-Design verbessert die Fangeffizienz. Der Einsatz automatisierter Elektrophoresegeräte von Agilent, wie dem 2100 Bioanalyzer, gewährleistet eine genaue Fragmentgrößenerkennung.
• Wiederholen von ElementenWiederholte Elemente können die gleichmäßige Verteilung der Reads im Exom beeinträchtigen, was eine erhöhte Sequenzierungstiefe für die SNP-Erkennung erforderlich macht.
• Abdeckungs-HomogenitätDie Sicherstellung einer einheitlichen Abdeckungstiefe über Regionen hinweg ist entscheidend für hochwertige Daten. Die Erreichung einer hohen Homogenität der Abdeckung erfordert eine sorgfältige Vorbereitung der Bibliothek. Methoden wie unverzerrte DNA-Fragmente, der Einsatz von Amplifikationsenzymen mit geringer GC-Gehalt-Präferenz, die Minimierung der PCR-Anreicherungszyklen und die Optimierung des Proben-Designs sowie der Hybridisierungsbedingungen verbessern die Homogenität der Abdeckung während der Erfassungsexperimente.

Anwendungen der gezielten Sequenzierung

Gezielte Sequenzierung dient als wertvolle Ergänzung zur Ganzgenomsequenzierung und optimiert sowohl experimentelle Verfahren als auch analytische Ziele. Ihre schnelle und effektive Natur hat sich eine einzigartige Nische in der Hochdurchsatzsequenzierung der nächsten Generation geschaffen, mit einem wachsenden Spektrum an Anwendungsbereichen.

• SNP-Typisierungstest: Zielgerichtete Sequenzierung erleichtert SNP-Typisierungstests und ermöglicht eine präzise Analyse genetischer Variationen.
• Whole Exome Sequencing: Gesamtes Exom-SequenzierungDurch die Fokussierung auf protein-codierende Regionen bietet die gesamte Exomsequenzierung mit gezielten Ansätzen Einblicke in genetische Variationen, die mit Krankheiten und Eigenschaften assoziiert sind.
• Linienidentifikation: Die gezielte Sequenzierung unterstützt die Identifizierung und Charakterisierung spezifischer genetischer Linien, die für Züchtungs- und genetische Studien von entscheidender Bedeutung sind.
• Populationsvererbung Analyse: Das Studium genetischer Variationen über Populationen hinweg hilft, die Vererbbarkeit und genetische Vielfalt zu verstehen, die für die Populationsgenetik und evolutionäre Studien von entscheidender Bedeutung sind.
• Blatt-OrganoidMitochondriale GenomsequenzierungGezielte Sequenzierung spezifischer Organellen-Genome oder gewebespezifischer Regionen liefert wertvolle Informationen zum Verständnis der Organoidentwicklung oder der mitochondrialen Genetik.
• Erfassungstechnologie: Zielgerichtete Erfassungstechnologien ermöglichen eine präzise Sequenzierung spezifischer genomischer Regionen und bieten Flexibilität und Effizienz im experimentellen Design.
• Dominante Merkmalscreening: Zielgerichtete Sequenzierung erleichtert die Identifizierung genetischer Varianten, die dominanten Merkmalen zugrunde liegen, und unterstützt die Merkmalskartierung sowie genetische Verbesserungsmaßnahmen.
• QTL-Lokalisierung: Quantitative Trait Locus (QTL) Kartierung unter Verwendung von gezielte Sequenzierung hilft, genomische Regionen zu identifizieren, die mit komplexen Merkmalen verbunden sind, und verbessert unser Verständnis der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen.
• Entwicklung molekularer Marker für die Zucht: Zielgerichtetes Sequenzieren trägt zur Entwicklung molekularer Marker für Zuchtprogramme bei, wodurch eine markergestützte Selektion und eine beschleunigte Verbesserung von Pflanzen ermöglicht werden.
• MethylierungssequenzierungGezielte Sequenzierung ermöglicht eine präzise Analyse von DNA-Methylierungsmustern und bietet Einblicke in die epigenetische Regulation und die Dynamik der Genexpression.
• Artenklassifikation, phylogenetische Entwicklung: Zielgerichtete Sequenzierung unterstützt die Artenklassifikation und phylogenetischen Studien, indem sie spezifische genomische Regionen oder Marker untersucht und so Einblicke in evolutionäre Beziehungen und Biodiversität gewährt.

Referenzen:

1. Bewicke-Copley, Findlay et al. "Anwendungen und Analysen der gezielten genomischen Sequenzierung in Krebsstudien." Journal für computergestützte und strukturelle Biotechnologie 17 (2019): 1348-1359.
2. Gulilat, Markus, et al. "Gezielte Next-Generation-Sequenzierung als Werkzeug für die Präzisionsmedizin." BMC medizinische Genomik 12 (2019): 1-17.