WGS vs. WES vs. gezielte Sequenzierungs-Panels

Was sind Exons?

Exons repräsentieren die Segmente des Genoms, die in der Lage sind, reife RNA zu transkribieren. Die Gesamtheit der Exons innerhalb eines Genoms bildet gemeinsam das, was als Exom bekannt ist. Es ist wichtig zu unterscheiden, dass der Begriff 'Whole-Exom-Sequenzierung' richtet sich speziell gegen Exons von protein-codierenden Genen, mit minimaler Beteiligung von nicht-codierenden Genen.

Der Begriff 'Gen' umfasst eine Sequenz von Nukleotiden in der DNA, die spezifische genetische Informationen trägt. Gene sind Fragmente des DNA-Moleküls mit erblichen Effekten und dienen als die grundlegenden Einheit der Vererbung, die biologische Merkmale reguliert. Die Intervalle menschlicher Gene variieren in der Größe und reichen von einigen hundert Basenpaaren (bp) bis über 2 Millionen bp. Das Humangenomprojekt schätzt, dass Menschen 20.000-25.000 protein-codierende Gene besitzen.

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Das 'Genom' umfasst alle genetischen Informationen innerhalb der DNA eines Organismus. Es besteht aus Genregionen und nicht-codierenden Regionen. Die Größe des menschlichen Genoms beträgt etwa 3 Milliarden Basenpaare (bp) (3 GB), wobei nicht-codierende Regionen den Großteil ausmachen, während protein-codierende Regionen nur etwa 2 % ausmachen.

Das Exom umfasst die Gesamtheit der Exons im Genom. Die menschlichen Exons zählen etwa 180.000 und machen etwa 1 % des menschlichen Genoms aus, was ungefähr 30 Millionen Basenpaaren (30 MB) entspricht.

Bitte lesen Sie unseren Artikel: Exom-Sequenzierung Fragen und Antworten für weitere Informationen.

Ein wichtiger Aspekt, der in Bezug auf Exons zu berücksichtigen ist, betrifft die untranslatierten Regionen (UTR). Dazu gehören sowohl 5'UTRs (führende Sequenzen) als auch 3'UTRs (schließende Sequenzen), die sich auf beiden Seiten der mRNA befinden. Ihre Hauptfunktion besteht darin, den Beginn und das Ende der Translation zu regulieren. Obwohl diese UTRs exone Sequenzen enthalten, ist es wichtig zu beachten, dass sie nicht in Aminosäuren übersetzt werden. Daher ist es entscheidend zu erkennen, dass nicht jede exone Sequenz in Aminosäuren übersetzt wird.

Bitte lesen Sie unseren Artikel. Die Methoden der gesamten Genomsequenzierung Für weitere Informationen über WGS.

Was ist die gesamte Exom-Sequenzierung?

Whole-Exom-Sequenzierung (WES)auch als Exom-Sequenzierung, gesamte Exom-Sequenzierung und ähnliche Variationen bezeichnet, ist eine Sequenzierungsmethode, die speziell entwickelt wurde, um das Exom zu analysieren, das alle Exons im Genom umfasst.

Im Gegensatz dazu umfasst die Ganzgenomsequenzierung (WGS) die Sequenzierung des gesamten Genoms und bietet einen umfassenden Überblick über die genetische Zusammensetzung eines Organismus. Andererseits, Gezielte Sequenzierungauch bekannt als Panel-Sequenzierung, konzentriert sich auf die Sequenzierung ausgewählter Gene, die typischerweise von einigen Dutzend bis zu tausend Genen reichen. Panel-Sequenzierung arbeitet nach zwei technischen Prinzipien: Hybridisierungsfang-Sequenzierung und multiplexe Amplicon-Sequenzierung. Der umfassende Ansatz wird durch die Nutzung von Prinzipien der Sequenzhybridisierung erreicht.

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Daher ist die Hierarchie in Bezug auf die Genomabdeckung wie folgt: Whole-Genome-Sequenzierung Whole-Exom-Sequenzierung gezielte Sequenzierung.

Es ist wichtig zu erkennen, dass die gesamte Exom-Sequenzierung als eine spezialisierte Form der gezielten Sequenzierung betrachtet werden kann, da ihr Fokus auf den gesamten exonschen Regionen im Genom liegt.

Tabelle 1 Unterschiede zwischen WGS, WES und gezielten NGS-Panels

Empfohlener Artikel: Wie man zwischen 100X Whole Exome Sequencing (WES) und 30X Whole Genome Sequencing (WGS) entscheidet?

Workflow der gesamten Exom-Sequenzierung

Der Whole Exome Sequencing (WES) Der Workflow kann grob in drei Hauptphasen unterteilt werden: Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und bioinformatische Analyse.

Bibliotheksvorbereitung

• Probenverarbeitung: Erste Handhabung von Proben zur DNA-Extraktion.
• DNA-Extraktion: Isolierung von DNA aus den verarbeiteten Proben.
• Quantifizierung: Messung der DNA-Konzentration, um eine angemessene Ausgangsmenge sicherzustellen.
• Bibliothekskonstruktion: Vorbereitung von DNA-Bibliotheken für das Sequenzieren.
• Hybridisierungsfängung: Anreicherung von Ziel-exonischen Regionen durch Hybridisierung.
• Amplifikation: Vervielfältigung von DNA-Fragmenten zur Erhöhung der Sequenzierungsempfindlichkeit.
• Qualitätskontrolle: Bewertung der Bibliotheksqualität zur Sicherstellung optimaler Sequenzierungsbedingungen.

Sequenzierung

Nutzung von Sequenzierungsplattformen, einschließlich ausländischer Plattformen wie Illumina und inländischer Plattformen wie die von UWI hergestellten.

Bioinformatikanalyse

• Qualitätskontrolle: Bewertung der Sequenzierungsdaten auf Zuverlässigkeit.
• Spleißen und Anpassen: Ausrichtung der Reads an das Referenzgenom.
• Entfernung von Duplikaten und Anordnung: Entfernung von doppelten Lesungen und Anordnung der Daten.
• Mutationsnachweis: Identifizierung genetischer Variationen und Mutationen.
• Rauschreduzierung und Filterung: Anwendung von Filtern zur Minimierung von Hintergrundgeräuschen.
• Annotation: Hinzufügung funktioneller Informationen zu identifizierten Varianten.
• Häufig verwendete Software: FastQC, BWA, GATK, ANNOVAR und andere.

Bitte lesen Sie unseren Artikel: Bioinformatik-Workflow der gesamten Exom-Sequenzierung.

Wie man gezielte Exom-Sequenzierungs-Panel-Sonden bewertet?

Bei der Bewertung der Leistung eines Exom-Panels Capture-SondeMehrere Kriterien spielen eine entscheidende Rolle. Ob man sich für Standardsonden entscheidet oder eine Anpassung in Betracht zieht, ist eine sorgfältige Überlegung unerlässlich. Hier sind wichtige Aspekte, die zu bewerten sind:

Probe-Bewertungskriterien

• Spezifität: Präzision beim Erfassen der beabsichtigten genomischen Regionen ohne Off-Target-Effekte.
• Empfindlichkeit: Fähigkeit, die Zielregionen effektiv zu erkennen und zu erfassen.
• Einheitlichkeit: Konsistente Abdeckung in den anvisierten Regionen ohne signifikante Verzerrung.
• Reproduzierbarkeit: Zuverlässige Leistung über mehrere Experimente und Wiederholungen hinweg.

Zusätzliche Überlegungen zu handelsüblichen Sonden

• Probengröße, Länge und Design: Kompatibilität mit Proben und Forschungsanforderungen.
• Ausrichtung an den Forschungszielen: Sicherstellen, dass das Proben-Set mit den Zielen der Studie übereinstimmt.

Anpassungsoptionen

• Anpassung an spezifische Bedürfnisse: Hinzufügen von Interessengebieten oder Gestaltung eines vollständig benutzerdefinierten Panels.
• Referenzdatenbanken: Nutzung von Datenbanken wie RefSeq, CCDS, Ensembl, GENCODE und ClinVar für die Sondenentwicklung.
• Sonden-Dichte: Anforderung zusätzlicher Sondendichten für bestimmte Regionen zur Verbesserung der Erfassungs-effizienz.

Besondere Merkmale in externen Sonden

• SNP-Stellen zur Probenidentifikation: Einige Sonden enthalten SNP-Stellen zur Probenverfolgung, um das Risiko von Kontaminationen in NGS-Experimenten zu minimieren.
• Automatisierung der Probenverfolgung: Nutzung von SNP-IDs zur Automatisierung der Probenidentifikation, wodurch menschliche Fehler im Vergleich zur manuellen Markerhinzufügung oder Index-Sequenzierungsbeschriftungen reduziert werden.
• Sequenzierungstiefe: Sicherstellung einer ausreichenden Tiefe für eine genaue SNP-basierte Probenverfolgung.

Häufig verwendete Kennzahlen zur Bewertung von WES-Proben

• Spezifität, Sensitivität, Einheitlichkeit und Reproduzierbarkeit: Wie bei der allgemeinen Bewertung von Sonden gelten diese Kennzahlen zur Bewertung von Hybridisierungsfangsonden, die in gezielte Sequenzierungeinschließlich Whole Exome Sequenzierung (WES).

5 Tipps zur Bewertung von Hybridisierungsfängern

Die Bewertung von WES-Proben umfasst häufig die folgenden Metriken. Da WES eine spezifische Art der gezielten Sequenzierung ist, können diese Metriken auch verwendet werden, um Hybridisierungsfangproben zu bewerten, die in anderen gezielten Sequenzierungen eingesetzt werden.

Zielgenauigkeit

Die On-Target-Rate ist ein entscheidender Prozentsatz, der angibt, inwieweit Sequenzierungsdaten mit der Zielregion übereinstimmen. Während Exons im Vordergrund stehen, weisen viele genomische Bereiche, wie Introns und intergenische Regionen, Homologie zu Exons auf. In der Praxis werden nicht-zielgerichtete (Exon-)Bereiche, die während der Hybridisierung erfasst werden, als Off-Target betrachtet. Off-Target-Daten gelten als ungültig und können in nachfolgenden Analysen nicht verwendet werden, was einen Verlust von Sequenzierungsressourcen darstellt. Eine höhere On-Target-Rate und reduzierter Off-Target-Abfall bedeuten eine effizientere Sonde.

Abdeckung

Coverage, oft gepaart mit Tiefe (z. B. "10X Coverage" oder "30X Coverage"), bezeichnet das Ausmaß, in dem Sequenzierungsreads ein bestimmtes Gebiet abdecken. Zum Beispiel bedeutet "10X Coverage von 90%", dass 90% der Sequenzierungsdaten das Zielgebiet mindestens 10 Mal abdecken. Wenn die Coverage nicht mit einer Tiefe angegeben wird, wird sie als "1X Coverage" interpretiert, was impliziert, dass das Gebiet von mindestens einem Read abgedeckt wird. Höhere Coverage und niedrigere Prozentsätze verpasster Ziele erhöhen die Effektivität der Sonde.

Homogenität

Homogenität bewertet die Gleichmäßigkeit der Abdeckung über verschiedene Standorte innerhalb der Zielregion. Ideale Uniformität stellt sicher, dass die Tiefe an jedem Standort eng mit der durchschnittlichen Tiefe übereinstimmt. Fold-80, eine Kennzahl zur Bewertung der Homogenität, repräsentiert die zusätzliche Sequenzierung, die erforderlich ist, um sicherzustellen, dass 80 % der Zielbasen die durchschnittliche Tiefe erreichen. Ein niedriger Fold-80 weist auf eine effiziente Erfassung hin und minimiert verschwenderische Sequenzierung. Sonden mit ausgezeichneter Homogenität tragen zu kosteneffizienter und effektiver Sequenzierung bei.

Duplikationsrate

Die Duplikationsrate spiegelt den Prozentsatz der doppelten Reads in der insgesamt sequenzierten Sequenz wider. Doppelte Reads, die keine zusätzlichen Informationen enthalten, werden in der nachgelagerten Analyse entfernt, um die Genauigkeit der Mutationsdetektion zu verbessern. Eine höhere Duplikationsrate verringert die Datennutzung, was zu verschwendeten Sequenzierungskosten führt. Niedrigere Duplikationsraten führen im gleichen Kontext zu Kosteneinsparungen, was die Effizienz der Sonde anzeigt.