Whole Exome Sequencing basierend auf dem Hybridisierungsfängungsprotokoll

Reinigung

1. Lassen Sie die AMPure XP-Perlen mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur kommen.
2. Mischen Sie das Reagenz gut in einem Vortex-Mischer, bis es homogen erscheint. Fügen Sie 180 μl homogene AMPure XP-Perlen zu einem 1,5-ml LoBind-Röhrchen hinzu und geben Sie die geschnittene DNA-Bibliothek (~120 μl) dazu.
3. Gut auf einem Vortex-Mischer mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Stellen Sie das Röhrchen in einen Magnetständer und warten Sie, bis die Lösung klar ist (3–5 Minuten).
5. Lassen Sie das Röhrchen im magnetischen Ständer. Entsorgen Sie die klare Lösung aus dem Röhrchen, ohne die Perlen zu stören.
6. Lassen Sie das Röhrchen weiterhin im magnetischen Ständer, während Sie 500 μl 70% Ethanol in jedes Röhrchen geben.
Lassen Sie das Röhrchen 1 Minute stehen, damit sich die gestörten Perlen setzen können, und entfernen Sie dann das Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
8. Trocknen Sie die Proben auf einem 37 °C Heizblock für 5 Minuten oder bis der verbleibende Ethanol vollständig verdampft ist.
9. Fügen Sie 30 μl nucleasefreies Wasser hinzu, mischen Sie gut auf einem Vortex-Mischer und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur.
10. Stellen Sie das Röhrchen in den Magnetständer und lassen Sie es 2–3 Minuten stehen oder bis die Lösung klar ist.
Entfernen Sie etwa 30 μl des Überstands in ein frisches 1,5-ml LoBind-Röhrchen.

Qualität bewerten

Verwenden Sie das Agilent DNA 1000 Chip- und Reagenzkit zur Vorbereitung des Chips mit Proben und Ladder.
Laden Sie den Chip in den 2100 Bioanalyzer und starten Sie den Lauf innerhalb von 5 Minuten nach der Vorbereitung.
3. Überprüfen Sie, ob das Elektropherogramm eine Verteilung mit einer Spitzenhöhe von etwa 190 Nukleotiden zeigt.

Endreparatur

1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch auf Eis vor. Gut auf einem Vortex-Mischer mischen. Fügen Sie 71 μl des Reaktionsgemisches und 29 μl der DNA-Probe zu jedem Röhrchen hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren.
2. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten bei 20 °C in einem Thermocycler. Verwenden Sie keinen beheizten Deckel.
3. Reinigen Sie die Probe mit 90 μl homogenen AMPure XP-Perlen gemäß der Anleitung. Eluieren Sie in 32 μl nukleasefreiem Wasser.

A-Tailing

1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch vor. Fügen Sie 32 μl jeder DNA-Probe in jede Vertiefung oder jedes Röhrchen hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren.
2. Inkubieren Sie in einem Thermocycler für 30 Minuten bei 37 °C, wobei die Deckeltemperatur 50 °C nicht überschreiten darf.
3. Reinigen Sie die Probe mit 90 μl homogenen AMPure XP-Perlen gemäß den Anweisungen und eluieren Sie in 15 μl nukleasefreiem Wasser.
4. Fahren Sie sofort mit dem Adapter-Ligation-Schritt fort.

Adapter-Ligation

1. Glühen Sie die Adapter.
2. Bereiten Sie die Reaktionsmischung vor.
Fügen Sie 36 μl der Reaktionsmischung und 14 μl der DNA-Probe zu jedem Röhrchen hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren.
4. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 20 °C in einem Thermocycler. Verwenden Sie keinen beheizten Deckel.
5. Reinigen Sie die Probe mit 90 μl homogenen AMPure XP-Perlen gemäß den Anweisungen. Eluieren Sie in 52 μl nukleasefreiem Wasser.

Vorhybridisierungsverstärkung

Verwenden Sie die Hälfte der adapter-ligierten Fragmente für die Amplifikation und lagern Sie die andere Hälfte bei -20 °C für eine zukünftige Verwendung, falls erforderlich.
2. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch (25 μl) gemäß den Anweisungen in Tabelle 5 vor und fügen Sie 25 μl jeder DNA-Probe zu jedem Röhrchen hinzu.
3. Mischen Sie durch Pipettieren und führen Sie das Programm aus.
4. Reinigen Sie die Probe mit 90 μl homogenen AMPure XP-Perlen und eluieren Sie in 30 μl nukleasefreiem Wasser.

Qualität und Quantität bewerten

Verwenden Sie das Agilent DNA 1000 Chip- und Reagenzkit zur Vorbereitung des Chips mit Proben und Ladder.
Laden Sie den Chip in den 2100 Bioanalyzer und starten Sie den Lauf innerhalb von 5 Minuten nach der Vorbereitung.
3. Bestimmen Sie nach dem Lauf die Konzentration der Probe durch Integration unter dem Peak.
4. Überprüfen Sie, ob das Elektropherogramm eine Verteilung mit einer Spitzenhöhe von 250 ± 10 % bp zeigt.

Hybridisierung

Konzentration eines 500-ng-Aliquots der Bibliothek auf 3,4 μl mit einem Vakuumkonzentrierer bei ≤45°C.
2. Mischen Sie die Komponenten, um die Blockmischung in einem PCR-Röhrchen vorzubereiten.
Fügen Sie 3,4 μl der vorbereiteten Bibliothek mit 147 ng/μl zu 5,6 μl SureSelect Block Mix (Röhrchen A) hinzu.
4. Mischen Sie die Komponenten in Tabelle 8 bei Raumtemperatur, um die Hybridisierungs-Pufferlösung (Röhrchen B) vorzubereiten.
5. Verdünnen Sie 1 μl RNase Block mit 2 μl nukleasefreiem Wasser.
6. In einem separaten Röhrchen 5 μl der SureSelect-Capture-Bibliothek mit 2 μl verdünntem RNase Block (Röhrchen C) mischen.
7. Platzieren Sie das Röhrchen "A" im Thermocycler mit folgendem Programm.
8. Verwenden Sie einen beheizten Deckel auf dem Thermocycler bei 105 °C während des gesamten Vorgangs.
9. Halten Sie den Zyklierer bei 65 °C, während Sie 40 μl Hybridisierungs-Puffer (Röhrchen B) hinzufügen.
Inkubieren Sie beide Röhrchen mindestens 5 Minuten bei 65 °C.
11. Platzieren Sie die Capture-Bibliotheksmischung (Tube C) im Zykler.
12. Inkubieren Sie die Proben 2 Minuten lang bei 65 °C.
13. Halten Sie den Zyklierer bei 65 °C, während Sie mit einer Pipette 13 μl Hybridisierungs-Puffer aus dem Rohr "B" entnehmen und ihn zur SureSelect-Erfassungsbibliotheksmischung im Rohr "C" hinzufügen.
14. Halten Sie den Zyklierer bei 65 °C und übertragen Sie den gesamten Inhalt des vorbereiteten Bibliotheksmixes aus Tube "A" in die Hybridisierungslösung in Tube "C."
15. Verschließen Sie das Rohr "C" sorgfältig und inkubieren Sie die Hybridisierungsmixtur 24 Stunden lang bei 65°C mit einem beheizten Deckel.

Vorbereitung von magnetischen Perlen

Halten Sie den SureSelect Waschpuffer #2 im Wasserbad bei 65 °C.
2. Lassen Sie die Dynal MyOne Streptavidin T1 (Invitrogen) Perlen mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur kommen.
3. Schütteln Sie kräftig auf einem Vortex-Mischer und nehmen Sie 50 μl magnetische Perlen in ein 1,5-ml-Mikrogefäß.
4. Wasche die Perlen:
Fügen Sie 200 μl SureSelect-Bindepuffer hinzu.
(b) Mischen Sie die Perlen 5 Sekunden lang auf einem Vortexmischer.
(c) Stellen Sie das Röhrchen in einen Magnetständer und warten Sie, bis die Lösung klar wird (3–5 Minuten).
(d) Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.
(e) Wiederholen Sie die Schritte (a bis d) insgesamt dreimal.
5. Resuspendieren Sie die Perlen in 200 μl SureSelect-Bindepuffer.

Hybrid-Erfassungswahl

1. Schätzen und protokollieren Sie das Volumen der Hybridisierung, das nach 24 Stunden Inkubation verbleib.
2. Fügen Sie das Hybridisierungs-Mix direkt aus dem Thermocycler zur Perlenlösung hinzu und mischen Sie, indem Sie drei bis fünf Mal umkehren.
3. Inkubieren Sie die Hybrid-Capture/Perlenlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Nutator oder einem gleichwertigen Gerät.
4. Stellen Sie sicher, dass der Inhalt richtig gemischt wird.
5. Kurz in einer Zentrifuge spinnen und die Perlen und Puffer auf einem Magnetseparator trennen.
6. Lassen Sie das Röhrchen 3–5 Minuten im magnetischen Ständer.
7. Entsorgen Sie die geklärte Lösung aus dem Rohr, ohne die Perlen zu stören.
8. Resuspendieren Sie die Perlen in 500 μl SureSelect Waschpuffer #1, indem Sie sie 5 Sekunden lang auf einem Vortex-Mischer mischen.
9. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gelegentlich auf einem Vortex-Mischer mischen.
10. Kurz in einer Zentrifuge spinnen, die Perlen und Puffer auf einem Magnetseparator trennen und den Überstand entfernen.
11. Waschen Sie die Perlen:
(a) Resuspendieren Sie die Perlen in 500 μl von auf 65 °C vorgeheiztem SureSelect Waschpuffer #2 und mischen Sie sie 5 Sekunden lang auf einem Vortex-Mischer, um die Perlen wieder in Suspension zu bringen.
(b) Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 65 °C in einem Heizblock oder einem entsprechenden Gerät. Gelegentlich auf einem Vortex-Mischer mischen.
(c) Kurz in einer Zentrifuge spinnen.
(d) Trennen Sie die Perlen und den Puffer auf einem Dynal-Magnetseparator und entfernen Sie den Überstand.
(e) Wiederholen Sie die Schritte (a bis d) insgesamt drei Mal. Entfernen Sie alle Rückstände des Waschpuffers, bevor Sie mit Schritt 12 fortfahren.
Mischen Sie die Perlen in 50 μl SureSelect Elutionspülflüssigkeit auf einem Vortex-Mischer für 5 Sekunden, um die Perlen wieder in Suspension zu bringen.
13. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur. Gelegentlich auf einem Vortex-Mischer mischen.
14. Drehen Sie kurz in einer Zentrifuge und trennen Sie die Perlen und den Puffer auf einem Magnetständer.
15. Übertragen Sie den Überstand (gefangenes DNA) in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
Fügen Sie 50 μl SureSelect Neutralization Buffer zu der gefangenen DNA hinzu und mischen Sie kurz.
17. Reinigen Sie die Probe mit 180 μl homogenen AMPure XP-Perlen gemäß der Anleitung und eluieren Sie in 30 μl nukleasefreiem Wasser.

Post-Hybridisierungs-Verstärkung

1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch auf Eis vor. Gut auf einem Vortex-Mischer mischen.
Fügen Sie 15 μl der DNA-Probe zu 35 μl des Reaktionsgemisches hinzu.
3. Mischen Sie durch Pipettieren, legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und starten Sie das Programm.
4. Reinigen Sie die Probe mit 90 μl homogenen AMPure XP-Perlen und eluieren Sie in 30 μl nukleasefreiem Wasser gemäß den Anweisungen.
5. Qualität und Quantität bewerten.
6. Bestimmen Sie die Konzentration der Probe durch Integration unter dem Peak.
7. Das Elektropherogramm sollte einen Peak im Größenbereich von etwa 300–400 Nukleotiden zeigen.
8. Führen Sie eine zusätzliche Quantifizierung mittels Echtzeit-PCR durch.

Cluster-Generierung

1. Verdünnen und denaturieren Sie die Bibliotheken auf 8 pM (∼1,6 pg/µl von 300 bp DNA) mit 0,1 N NaOH.
2. Tauchen Sie die Reagenzien auf und bereiten Sie sie gemäß den Anweisungen des Illumina Cluster Generation Kits vor.
3. Öffnen Sie das entsprechende Rezept und führen Sie es auf der Clusterstation aus.
4. Befolgen Sie die Rezeptanweisungen, um die Flusszelle zu laden.
5. Folgen Sie den Rezeptanweisungen, um Reagenzien zu laden.
6. Vervollständigen Sie die Schritte zur Clustererzeugung: Hybridisierung, Amplifikation, Linearisierung, Blockierung und Primer-Hybridisierung.
7. Nehmen Sie die Flusszelle für die Sequenzierung.

Sequenzierung

Führen Sie einen Vorlauf-Waschschritt am Sequencer durch.
2. Tauchen Sie das Sequenzierungsreagenz auf und bereiten Sie es gemäß den Anweisungen des Sequenzierungskits vor.
3. Lade Sequenzierungsreagenz.
4. Prime Positionen auf dem Genom-Analyzer.
5. Reinigen und installieren Sie das Prisma und die Flusszelle.
6. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Abgabe des Reagenz und tragen Sie Öl auf.
7. Führen Sie die Einfügung der ersten Base von Read 1 und die automatische Kalibrierung durch.
8. Überprüfen Sie die Qualitätsmetriken.
9. Führen Sie den Lauf für die gewünschte Anzahl von Zyklen fort.

Referenz:

1. Priya R R, Rajasimha H K, Brooks M J, et al. Exom-Sequenzierung: Erfassung und Sequenzierung aller menschlichen kodierenden Regionen zur Entdeckung von Krankheitsgenen. Retinale Entwicklung: Methoden und Protokolle, 2012: 335-351.