Wie entscheidet man sich zwischen 100X Whole Exome Sequencing (WES) und 30X Whole Genome Sequencing (WGS)?

Whole Exome Sequenzierung (WES)

Whole Exome Sequencing (WES) ist eine hochmoderne Technologie, die sich auf die exonen Abschnitte des menschlichen Genoms konzentriert, die nur 1,5 % des gesamten Genoms ausmachen. Diese Exons sind entscheidend, da sie die Mehrheit der bekannten krankheitsverursachenden Mutationen beherbergen. WES verwendet Sonden oder Amplicon-Sequenzierungstechniken, um selektiv DNA innerhalb dieser exonen Regionen zu zielen und zu sequenzieren. Diese Präzision ermöglicht die Identifizierung genetischer Mutationen, die eine entscheidende Rolle in der Proteinfunktion spielen. Um robuste Ergebnisse zu gewährleisten, empfehlen Experten eine Sequierungstiefe von mindestens 100X, was etwa 12G Daten entspricht.

WES zeichnet sich dadurch aus, dass es die Kosten- und Tiefenbeschränkungen der gesamten Genomresequenzierung überwindet. Es bietet eine hohe Sequenzierungstiefe, Kosteneffizienz und die Möglichkeit, direkt protein-codierende Sequenzen auf Varianten zu untersuchen, die die Proteinstruktur beeinflussen. Die tiefe Sequenzierungskapazität erleichtert die Identifizierung von häufigen, niedrigfrequenten und seltenen Varianten. Darüber hinaus, WES zielt ausschließlich auf exone Regionen ab, was die Kosten, Durchlaufzeiten und Arbeitsbelastungen erheblich reduziert. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass WES Einschränkungen bei der Erkennung von Kopienzahlvariationen (CNVs) und strukturellen Varianten (SVs) haben kann, aufgrund seiner Präferenz während des Erfassungsprozesses und der begrenzten Abdeckung nicht-kodierender Regionen.

Vorteile von WES

• Krankheitsverursachende Mutationen: Etwa 85 % der bekannten krankheitsverursachenden Mutationen bei menschlichen Krankheiten befinden sich im Exon-Bereich, was WES ein leistungsstarkes Werkzeug zur Erforschung neuer krankheitsbezogener Gene beim Menschen.
• Diagnostische Ausbeute: WES erzielt eine höhere diagnostische Erfolgsquote bei Patienten, die eng verwandt sind, schwere Symptome aufweisen oder multiple Symptome zeigen.
• Reiche Annotationen: WES deckt über 85 % der krankheitsverursachenden Mutationen ab, einschließlich derjenigen in nicht-codierenden Regionen. Es profitiert auch von umfangreichen Datenbank- und Literaturannotationen, die Kliniker bei der Interpretation unterstützen.
• Varianten im kodierenden Bereich: WES ist darauf spezialisiert, Varianten mit ungewisser Bedeutung (VUS) im kodierenden Bereich zu erkennen, was für die Exomforschung entscheidend ist.

Mängel von WES

• Fehlende nicht-codierende Mutationen: Etwa 10 % der bekannten krankheitsverursachenden Mutationen, die mit menschlichen Krankheiten in Verbindung stehen, befinden sich in nicht-codierenden Regionen, was möglicherweise eine Entdeckung durch WES erschwert.
• Herausforderungen mit einzigartigen genomischen Regionen: WES kann Schwierigkeiten haben, genomische Regionen mit hohem GC-Gehalt, repetitiven Sequenzen oder Pseudogenen zu erfassen.
• Komplexe Mutationen: Die Erkennung spezifischer Mutationsarten, wie komplexer Kopienzahlvarianten und struktureller Abnormalitäten, kann mit WES herausfordernd sein.

Whole Genome Sequenzierung (WGS)

Whole Genome Sequencing (WGS) - Gesamtes Genom-Sequenzierung (WGS) steht als eine hochmoderne genetische Analysetechnik, die das sorgfältige Sequenzieren des gesamten Genoms eines Individuums umfasst. Anschließend werden diese sequenzierten DNA-Fragmente mit einem Referenzgenom verglichen, was die Erkennung genetischer Variationen ermöglicht. Ein herausragendes Merkmal von WGS ist seine unvergleichliche Fähigkeit, Informationen aus den nicht-kodierenden Regionen des Genoms zu enthüllen, ein entscheidender Faktor für das Verständnis der genetischen Grundlagen komplexer Krankheiten. Wenn Ihre Forschung sich mit nicht-kodierenden und strukturellen genetischen Variationen beschäftigt oder wenn Sie nur begrenzte Kenntnisse über die Krankheitspathologie haben, dann ist WGS die bevorzugte Technologie.

Typischerweise strebt WGS an, eine Sequenzierungstiefe von mindestens 30X oder höher zu erreichen, was ein erhebliches Datenvolumen ergibt, das oft 90 Gigabyte übersteigt. Dennoch ist es wichtig anzuerkennen, dass WGS kommt mit einer Reihe von Einschränkungen, die die hohen Kosten, die Datenkomplexität und die Schwierigkeiten bei der Interpretation von Varianten mit geringer Häufigkeit aufgrund der relativ geringen Sequenzierungstiefe umfassen.

Ein herausragender Vorteil der WGS ist ihr umfassender Umfang; sie macht einen vorherigen Erfassungsschritt überflüssig und umfasst das gesamte Genom. Diese Methodik umfasst nicht nur kodierende Regionen, sondern erstreckt sich auch auf nicht-kodierende und regulatorische Bereiche. Darüber hinaus zeichnet sich die WGS durch die Erkennung von strukturellen Varianten aus, einschließlich balancierter Translokationen und Inversionen.

Es gibt jedoch mehrere Mängel, die mit WGS verbunden sind.

• Herausforderungen in hoch repetitiven oder homologen Regionen: Das präzise Erkennen und Analysieren von Regionen des Genoms, die stark repetitiv oder homolog sind, kann eine Herausforderung darstellen, da die Unterscheidung zwischen diesen Regionen eine anspruchsvolle Aufgabe sein kann.
• Ungewisse funktionale Bedeutung neu entdeckter Varianten: Wenn neuartige genetische Varianten aufgedeckt werden, kann ihre funktionale Bedeutung im Unklaren bleiben, was eine weitere Validierung erforderlich macht. Dies stellt eine erhebliche Herausforderung für Kliniker dar, die mit der Interpretation dieser Ergebnisse betraut sind.
• Einschränkungen des Referenzgenoms: Die Referenzsequenz des menschlichen Genoms wurde auf der Grundlage einer begrenzten Anzahl von Individuen erstellt, was zu potenziellen Fehlern und Lücken in der Referenzsequenz führen kann. Dies kann wiederum sowohl zu falsch-positiven als auch zu falsch-negativen Identifikationen genetischer Varianten führen.
• Unvollständige Abdeckung von Regionen mit hohem GC-Gehalt: WGS kann unvollständige Abdeckung von genomischen Regionen mit hohem GC-Gehalt bieten, was möglicherweise die Datengenauigkeit beeinträchtigt.
• Niedrige Sequenzierungstiefe und beeinträchtigte Präzision der Mutationsanalyse: Die relativ bescheidene durchschnittliche Sequenzierungstiefe von 30X in der WGS kann die Genauigkeit der Mutationsanalyse verringern, was möglicherweise eine erhebliche Anzahl von falsch-positiven Mutationen zur Folge hat. Diese falsch-positiven Ergebnisse erfordern zusätzliche Validierungsschritte, wodurch der Prozess der Interpretation und Bestätigung komplizierter wird.

Vergleich von WES- und WGS-Daten mit einer Sequenzierungstiefe von 75X

wenn wir WES- und WGS-Daten mit einer identischen Abdeckung von 75X bewerten, um den Anteil der bekannten Varianten innerhalb der Probe zu bestimmen, die unentdeckt bleiben (falsch-negative Varianten), zeigen die Ergebnisse einen deutlichen Gegensatz. Konkret liegt die falsch-negative Rate für WES bei 2,17%, während WGS weist eine bemerkenswert niedrigere falsch-negative Rate von nur 0,022% auf. Anders ausgedrückt, könnte WES bei 75-facher Abdeckung 2 von 100 Varianten übersehen, während WGS bei derselben Abdeckung nur 2 von 10.000 Varianten verpasst. Dies unterstreicht die erhebliche Überlegenheit von WGS sowohl in Bezug auf die Sensitivität als auch auf den positiven prädiktiven Wert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Unterschied zwischen WES, das eine höhere Sequenzierungstiefe (100X) erfordert, im Vergleich zu 30X für WGS, auf den ersten Blick nicht signifikant erscheinen mag. Dennoch ist es wichtig zu erkennen, dass WGS in der umfassenden Erkennung verschiedener Variantentypen, insbesondere in nicht-kodierenden Regionen, überlegen ist. Daher sollte die Wahl zwischen WES und WGS von den spezifischen Anforderungen der Forschung oder Diagnose sowie von Überlegungen zu Budget und Datenverarbeitung abhängen.

Eine Studie aus dem Jahr 2018 verglich die Vorzüge von Whole-Exom-Sequenzierung und Whole-Genome-SequenzierungDiese Forschung umfasste simultane WES unter Verwendung der ION Proton-Plattform bei 70 Teilnehmern und erreichte eine durchschnittliche Sequierungstiefe von über 100X. Die Ergebnisse zeigten, dass 35 dieser Teilnehmer eine definitive molekulare Diagnose erhielten, während WES bei neun Patienten keine krankheitsverursachenden Mutationen identifizieren konnte, die jedoch durch WGS erfolgreich nachgewiesen wurden. Diese übersehenen Loci umfassten einzelne Nukleotidvarianten (SNVs) gelegen in tiefen Introns, kleinen Kopiezahlvariationen (CNVs), SNVs in nicht-kodierenden Regionen, mitochondrialen Varianten und SNVs mit geringer Exonabdeckung. Es ist wichtig zu beachten, dass alternative Erfassungsmethoden möglicherweise nicht auf dieselben Einschränkungen stoßen.

Daher sollte die Auswahl zwischen WES und WGS auf den spezifischen Anforderungen der Studie oder Diagnose sowie auf budgetären und datenverarbeitenden Überlegungen basieren.

Referenz:

1. Lionel, Anath C., et al. "Die verbesserte diagnostische Ausbeute im Vergleich zu gezielten Gen-Sequenzierungs-Panels deutet auf eine Rolle der Ganzgenomsequenzierung als Erstlinien-Gentest hin." Genetik in der Medizin 20.4 (2018): 435-443.