Exom-Sequenzierung Q&A

Allgemeine Fragen

Ja, wenn das Referenzgenom nicht verfügbar ist, sollte die Sequenz der eng verwandten Art bereitgestellt werden, aber die Zuverlässigkeit der Ergebnisse der Erfassung kann nicht garantiert werden. Denn die Erfassungsprobe ist basierend auf dem Referenzsequenz vorausgesetzt, es wird nicht empfohlen, wenn bekannt ist, dass die Zielregion eine große Diskrepanz mit dem Verhältnis des Referenzgenoms aufweist, wie zum Beispiel eine insertionale Deletion eines großen Fragmentes.

Die Sequenzierungstiefe repräsentiert die Anzahl der Male, die die Sequenz durch das Sonden-Set abgedeckt wird. Je höher die Zahl, desto genauer ist die Identifizierung der Sequierungsergebnisse und desto präziser die anschließende statistische Analyse. Bei Tumor- und Studien zu Mutationen mit niedriger Frequenz wird empfohlen, dass die Sequenzierungstiefe mindestens 150× oder mehr betragen sollte. Wenn Sie nur klassische SNPs und keine Mutationen mit niedriger Frequenz betrachten, sollte die Sequenzierungstiefe mindestens 30× oder mehr betragen. Methode zur Umrechnung der Sequenzierungstiefe: Die allgemeine Effizienz der Zielregionserfassung liegt bei 60-70%, die Größe der Zielregion bei der Exon-Erfassung beträgt etwa 60Mb, d.h. Sequenzierungstiefe = 10G*60%/60Mb = 100×.

Die gesamte Exom-Sequenzierung hat einen Hybridisierungsfängungsprozess, sodass es ein Problem mit der Effizienz der Hybridisierungsfängung gibt. Die Hybridisierungseffizienz jedes Exons ist unterschiedlich, und der homologe Wettbewerb ist ebenfalls unterschiedlich, sodass die Abdeckung verschiedener Exons sehr unterschiedlich ist. Daher kann die Exon-Sequenzierung im Allgemeinen nicht zur Erkennung von CNV verwendet werden. In der Krebsforschung kann CNV jedoch unter Verwendung von krebsartigem und parakrebsartigem Gewebe als Kontrollen nachgewiesen werden. Es gibt zwei weitere konventionelle Methoden zur Erkennung von CNV, eine ist Whole-Genome-Resequenzierung und das andere ist mit SNP-Mikroarray.

Ja, solange das erfasste Zielfragment ein entsprechendes Referenzgenom hat, kann es durch die Sonde erfasst werden. Beispiele sind virale Sequenzen, die im Wirtsgenom integriert sind, parasitäre Sequenzen, die im Blut vermischt sind, und Sequenzen von Mikroben mit geringer Häufigkeit in Umweltproben usw. Da der Anteil dieser Sequenzen in einer Mischprobe oft sehr gering ist, kann die Effizienz traditioneller Nachsequenzierungsmethoden sehr niedrig sein, was sehr hohe Sequenzierungsvolumina erfordert, um eine ausreichende Abdeckungstiefe zu erreichen, während eine große Menge redundanter Daten erzeugt wird. Die Zielerfassungsequenzierung hat in dieser Hinsicht einen klaren Vorteil.

Ja, aber es wird einige Auswirkungen auf die Erfassungs-effizienz dieser Fragmente geben. Ebenso sind Fragmente mit niedriger Komplexität und Fragmente mit mehrdeutigen Basen ebenfalls schwer zu erfassen. Bei der Gestaltung der Sonden werden die Techniker von Euromonitor die Anzahl der Abdeckung und die Sondendichte entsprechend der Abdeckung erhöhen und die erwarteten Erfassungsergebnisse zur Bestätigung an den Kunden senden. Darüber hinaus können für die Erfassung ganzer Exons, UTRs usw. vordefinierte Sonden-Sets verwendet werden. Diese Sonden sind so konzipiert, dass sie die Fragmente optimieren, die schwerer zu erfassen sind, und die entsprechende Erfassungseffizienz verbessern.

Es gibt vordefinierte Sondenprodukte sowohl für den Menschen als auch für einige gängige Arten für die gesamte Exon-Erfassung, mit mehreren Versionen der für den Menschen optimierten gesamten Exon-Sonde. Wenn die Zielregion groß ist und alle Exons (zehn Mb oder mehr) umfasst, wird empfohlen, die gesamte Exon-Erfassung direkt zu wählen, da ganze Exons mit einem reifer gestalteten Sonden-Set besser erfasst werden und kostengünstiger sind. Für kleinere Zielfragmente oder für Regionen jenseits der Exons, die ebenfalls von Interesse sind, werden maßgeschneiderte Sonden empfohlen.

Ja, es gibt keine Artenbeschränkung für die Zielerfassung-Sequenzierung Für die Plattform sind nur die Informationen zur Genomsequenz und zur Zielregion erforderlich. Selbst wenn das Referenzgenom einer Art relativ neu, ungenau oder sogar sehr unterschiedlich ist, kann ein Capture-Sequencing-Design erstellt werden. Die Capture-Sonden werden jedoch basierend auf den vom Kunden bereitgestellten Sequenzen entworfen, weshalb die Genauigkeit der Ergebnisse nicht vollständig garantiert werden kann.

Wenn jedoch die Kontamination mit Proteinen und anderen Verunreinigungen schwerwiegend ist, wirkt sich dies auf die Quantifizierung und die Enzymeffizienz beim Aufbau der Bibliothek aus, was die Erfolgsquote beim Bibliotheksaufbau verringert; RNA-Kontamination beeinflusst hauptsächlich die Quantifizierung der Proben und die Sortierung von DNA beim Bibliotheksaufbau; daher wird empfohlen, bei vorhandener RNA-Kontamination eine RNA-Digestion durchzuführen, sofern die Gesamtmenge und die Qualität der Proben geeignet sind.

Entnehmen Sie 5 mL peripheres Blut (normalerweise morgens oder früh am Morgen), übertragen Sie es schnell in ein EDTA-Antikoagulationsröhrchen, kippen Sie es vorsichtig und mischen Sie es (um Hämolyse zu vermeiden); trennen Sie das Plasma innerhalb von 1 Stunde (bei Raumtemperatur) oder 2 Stunden (bei 4°C): Zentrifugieren Sie bei 1.000 U/min für 10 Minuten bei 4°C, aspirieren Sie vorsichtig das Plasma in ein sauberes 1,5 mL EP-Röhrchen (achten Sie darauf, das Plasma nicht zu aspirieren). Zentrifugieren Sie dann bei 12.000 U/min für 10 Minuten bei 4°C, um verbleibende Zellen oder Rückstände zu entfernen, aspirieren Sie vorsichtig das gewünschte Volumen des Überstands in ein neues EP-Röhrchen, kennzeichnen Sie es mit einem ölbasierenden Marker, lagern Sie es in einem Ultratiefkühlschrank bei -80°C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen, und transportieren Sie die Probe auf Trockeneis.