Sequenzierungstechnologie für das eukaryotische Transkriptom: Mechanismen, Technologien, Anwendungen und Herausforderungen

Der eukaryotische Transkriptionsprozess ist der zentrale Zusammenhang der Regulation der Genexpression, und seine präzise Regulierung ist wichtig für das Zellwachstum, die Differenzierung, die Entwicklung und die Reaktion auf externe Umweltstimuli. Das Hauptziel der Sequenzierung der eukaryotischen Transkription besteht darin, die Schlüsselbiologischen Prozesse wie Transkriptionsaktivität, Spleißvariationen und Promoternutzung tiefgehend zu verstehen. Diese Informationen sind wichtig, um die grundlegenden Gesetze der Lebensvorgänge aufzudecken, den Mechanismus des Auftretens und der Entwicklung von Krankheiten zu erforschen und neue therapeutische Strategien zu entwickeln.

Dieses Papier führt hauptsächlich in die Transkriptions- und Sequenzierungstechnologie von Eukaryoten ein, erörtert deren Anwendung, analysiert die Einschränkungen der aktuellen Technologie und blickt auf die zukünftige Entwicklungsrichtung.

Warum eukaryotische Transkription sequenzieren?

Das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten stehen in engem Zusammenhang mit der Abnormalität des Transkriptionsprozesses. Am Beispiel von Krebs sind unkontrollierte Proliferation, Invasion und Metastasierung von Tumorzellen oft mit einer Reihe von Veränderungen in der Gen-Transkriptionsaktivität und abnormalen Spleißvariationen verbunden. Durch die Sequenzierung der eukaryotischen Transkription können Wissenschaftler diese abnormalen Veränderungen genau erfassen, Schlüsselgene und transkriptionsregulatorische Faktoren im Zusammenhang mit Krebs entdecken, spezifische Biomarker für die Früherkennung von Tumoren bereitstellen und zudem die Richtung für gezielte Therapieansätze aufzeigen.

Transkriptom-Sequenzierung ist von großer Bedeutung für das Verständnis von genregulatorischen Netzwerken. Der Promotor, als zentrales regulatorisches Element der Initiation der Gentranskription, weist eine hohe räumliche und zeitliche Spezifität auf. Unter verschiedenen Zelltypen, Entwicklungsstadien und Umweltbedingungen gibt es Unterschiede in der Auswahl und Aktivierung von Promotoren, was wichtig ist, damit Zellen funktionale Spezifität erreichen und das innere Gleichgewicht aufrechterhalten können. Mit Hilfe der Transkriptom-Sequenzierungstechnologie können Forscher Promotoren genau identifizieren, ihre Nutzungsregeln analysieren und dann die Regulationsmechanismen der Genexpression in zeitlichen und räumlichen Dimensionen tiefgehend erforschen sowie ein perfekteres Modell des Genregulationsnetzwerks aufbauen.

Die Sequenzierung des eukaryotischen Transkriptoms hilft nicht nur, die grundlegenden Gesetze der Lebensvorgänge zu analysieren, sondern bietet auch starke technische Unterstützung und eine theoretische Grundlage zur Überwindung schwerwiegender Krankheiten und zur Förderung der medizinischen Entwicklung und nimmt eine unersetzliche, wichtige Stellung in der Lebenswissenschaftsforschung ein.

Die Identifizierung von differentieller Exon-Spleißung durch RNA-seq (Cloonan et al., 2008)

Überblick über wichtige Sequenzierungstechnologien des eukaryotischen Transkriptoms

Die Schlüssel-Sequenzierungstechnologie ist ein unverzichtbares Kernwerkzeug im Prozess der Forschung zur eukaryotischen Transkription. Von der Analyse RNA-Seq Von dem gesamten RNA-Expressionsniveau, um den Transkriptionsstartpunkt genau zu lokalisieren und dann die komplexe Transkriptstruktur zu analysieren, haben sie synergistisch entwickelt und bieten somit solide technische Unterstützung für den Mechanismus der Transkriptionsregulation.

RNA-Seq

RNA-Seq ist eine der am häufigsten verwendeten Technologien zur Transkriptom-Sequenzierung, die in der Lage ist, die gesamte RNA in Proben umfassend zu analysieren. Je nach den unterschiedlichen Analyseobjekten kann sie in PolyA+ RNA-Seq und totale RNA-Seq unterteilt werden.

A. PolyA+ RNA-seq

a) Analyseobjekt: Hauptsächlich reife mRNA-Sequenzen mit einem Poly-A-Schwanz.

b) Anreicherungsmethode: Die meisten eukaryotischen mRNAs durchlaufen nach der Transkription eine Modifikation zur Anfügung eines Schwanzes, um einen PolyA-Schwanz zu bilden, was die Anreicherung von polyA-schwanztragenden mRNAs mithilfe von Oligo (dT) Magnetperlen ermöglicht.

c) Anwendungen: Bestimmt genau die mRNA-Expressionsniveaus. Identifiziert neue Transkripte. Analysiert alternative Spleißereignisse.

d) Vorteile: Konzentriert sich auf reifes mRNA und liefert klare Informationen zur Genexpression. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Analyse von Genexpressionsprofilen und dem Screening von differentiell exprimierten Genen.

B. Gesamt-RNA-Sequenzierung

a) Analyseobjekt: Sequenziert alle RNA-Moleküle in der Probe, einschließlich mRNA, rRNA, tRNA, lncRNA und miRNA.

b) Vorteil: Bietet umfassendere Transkriptominformationen im Vergleich zu PolyA+ RNA-seq. Ermöglicht die Analyse der mRNA-Expression und -Variationen sowie eine eingehende Untersuchung der Funktionen von nicht-kodierender RNA (ncRNA). Es kann auch neue lncRNAs identifizieren, ihre Wechselwirkungen mit mRNA untersuchen und ihre Rollen in der Regulierung der Genexpression analysieren.

c) Herausforderungen: Aufgrund des hohen Anteils von rRNA in der Gesamt-RNA (in der Regel >80%) sind spezielle Technologien zur Depletion von rRNA erforderlich, um die Abdeckung anderer RNA-Moleküle und die Genauigkeit der Analysen zu verbessern.

Übersicht über das RNA-seq-Experiment (Mathew et al., 2015)

CAGE-seq

Die Cap-Analyse der Genexpressions-Sequenzierung (CAGE-seq) ist eine Sequenzierungstechnik, die speziell verwendet wird, um den Transkriptionsstartort (TSS) präzise zu lokalisieren. Ihr Prinzip basiert auf der spezifischen Erkennung und Analyse der Hutstruktur am 5'-Ende von mRNA. Bei Eukaryoten hat das 5'-Ende von mRNA normalerweise eine spezielle Hutstruktur. CAGE-seq schneidet die mRNA mit einem Enzym, das die Hutstruktur spezifisch erkennt, in kurze Fragmente und sequenziert dann diese kurzen Fragmente.

Da die Anfangspositionen dieser kurzen Fragmente den Transkriptionsstartstellen entsprechen, können durch die Analyse von Sequenzierungsdaten die Transkriptionsstartstellen im gesamten Genom genau identifiziert und die Häufigkeit der Nutzung verschiedener Promotoren bestimmt werden. CAGE-seq kann nicht nur die Transkriptionsstartstellen bekannter Gene identifizieren, sondern auch neue Transkriptionsstartstellen und Promotoren finden, was von großer Bedeutung für die weitere Untersuchung des molekularen Mechanismus der Gen-Transkriptionsregulation ist.

CAGE-seq identifiziert TBX3-regulierte Treiber der Metastasierung (Amaia et al., 2023)

Langzeit-Sequenzierung

Long-Read-Sequenzierung, vertreten durch PacBio und Oxford Nanopore, zeigt einzigartige Vorteile im Bereich der Transkriptomforschung. Die traditionelle Short-Read-Sequenzierung ist durch die Leselänge eingeschränkt, was es schwierig macht, komplexe Transkriptstrukturen abzudecken. Im Gegensatz dazu kann die Long-Read-Sequenzierung vollständige Transkripte direkt sequenzieren und bewahrt vollständige Informationen von den 5'- bis zu den 3'-Enden.

A. Nachweis von Spleißisoformen

a) Long-Read-Sequenzierung zeichnet sich durch die Identifizierung von Spleißisomeren aus, indem sie alternative Spleißereignisse wie Exon-Skipping und Intron-Retention genau erkennt.

b) Es ermöglicht die Analyse verschiedener mRNA-Subtypen, die durch Transkription aus demselben Gen erzeugt werden, und liefert direkte Beweise für das Verständnis post-transkriptionaler Regulationsmechanismen.

B. Umfassende Transkriptionanalyse

a) Durch die Erfassung vollständiger Transkripte kann das Langzeit-Sequenzieren neue Transkripte identifizieren und die Transkriptionsstart- und -terminierungsstellen genau bestimmen.

b) Dies erleichtert eine eingehende Analyse der Transkriptstrukturen und Ausdrucksmuster.

C. Potenzial zur Erkennung von Basismodifikationen

a) Die Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung von PacBio und die Nanopore-Sequenzierungstechnologien von Oxford Nanopore haben das Potenzial, Basismodifikationen (z. B. Methylierung) nachzuweisen.

b) Dies erweitert die Transkriptomforschung von einfacher Sequenzanalyse auf die epigenomische Ebene und fördert erheblich die Studien zu den regulatorischen Mechanismen der Genexpression in Eukaryoten.

scRNA-seq

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) Technologie kann das Transkriptom auf Einzelzellebene analysieren und die Heterogenität zwischen Zellen aufdecken. Bei der traditionellen Transkriptomsequenzierung wird das gemischte RNA von Zellen analysiert, was die Unterschiede zwischen den Zellen verschleiern kann. ScRNA-seq kann das einzigartige Transkriptionsprofil jeder Zelle erhalten, indem die RNA einer einzelnen Zelle isoliert, amplifiziert und sequenziert wird.

Derzeit hat sich die scRNA-seq-Technologie in verschiedene experimentelle Methoden und Plattformen entwickelt, wie z.B. Drop-seq, 10x Genomics usw. Diese Technologien ermöglichen die Durchführung von Qualcomms Einzelzell-Transkriptomanalysen. ScRNA-seq wird häufig in der Forschung zu Zell-Differenzierung, embryonaler Entwicklung, Tumorheterogenität und anderen Bereichen eingesetzt. Es kann verschiedene Zelluntergruppen identifizieren, die molekularen Mechanismen des Zellschicksals aufdecken und die Heterogenität sowie potenzielle therapeutische Ziele in Tumorzellen entdecken.

Überblick über verschiedene Analysen von scRNA-seq-Daten (Chen et al., 2019)

Anwendungen in Studien zur Transkriptomsequenzierung bei Eukaryoten

Die Anwendung der eukaryotischen Transkriptions- und Sequenzierungstechnologie hat die Entwicklung der Lebenswissenschaften erheblich gefördert. Durch die eingehende Analyse des Transkriptoms kann diese Technologie die Transkriptionsregulationsmechanismen aus der Genexpression, dem alternativen Spleißen, der Regulation durch Transkriptionsfaktoren und anderen Aspekten aufdecken und wichtige Informationen sowie Forschungsideen für die Erforschung bedeutender biologischer Prozesse wie biologische Entwicklung und Krankheitsentstehung bereitstellen.

Genexpressionsprofil

Die Analyse von Genexpressionsprofilen ist eine der wichtigen Anwendungen der eukaryotischen Transkriptom-Sequenzierung. Durch RNA-seq und andere Technologien kann das Genexpressionsniveau von Zellen, Geweben oder Organismen in verschiedenen physiologischen Zuständen, Entwicklungsstadien oder Umweltbedingungen umfassend bestimmt und eine Genexpressionskarte erstellt werden. In der Tumorforschung können durch den Vergleich der Genexpressionsprofile von Tumorgeweben und normalen Geweben differentielle exprimierte Gene identifiziert werden, die eng mit dem Auftreten und der Entwicklung von Tumoren verbunden sein können. Eine weitere funktionelle Anreicherung und Signalweg-Analyse dieser differentielle exprimierten Gene kann den molekularen Mechanismus des Tumorauftritts aufdecken und potenzielle Biomarker sowie therapeutische Ziele für die Tumordiagnose und -behandlung bieten.

Phylogenetische Expressionsprofilierung zeigt koordinierte Evolution innerhalb von Gen-Sets (Martin et al., 2018)

Alternative Spleißung und lncRNA-Entdeckung

Die Transkriptom-Sequenzierungstechnologie spielt eine Schlüsselrolle bei der alternativen Spleißung und der Entdeckung von lncRNA. RNA-Seq sowie Langlese- und Langsequenzierungstechniken können die alternativen Spleißereignisse von Genen umfassend identifizieren und die Expressionsmuster verschiedener Spleißisomere in unterschiedlichen Zelltypen, Geweben oder physiologischen Zuständen analysieren. Durch die eingehende Untersuchung alternativer Spleißereignisse können wir ihre regulatorischen Mechanismen im Prozess der biologischen Entwicklung und des Auftretens von Krankheiten aufdecken.

Gleichzeitig ist die Transkriptom-Sequenzierungstechnologie auch ein wichtiges Mittel zur Entdeckung neuer lncRNAs. Die Gesamt-RNA-Sequenzierung und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung können lncRNAs mit geringer Häufigkeit nachweisen und ihre Funktion durch bioinformatische Analysen vorhersagen. Viele Studien haben gezeigt, dass lncRNA eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression, der Chromatinmodifikation und der Zell-Differenzierung spielt. Die Entdeckung neuer lncRNAs und das Studium ihrer Wechselwirkungen mit anderen Genen werden dazu beitragen, das komplexe Netzwerk der Regulation der Genexpression zu verstehen.

Zielerkennung von Transkriptionsfaktoren

Transkriptionsfaktoren sind die Schlüsselproteine zur Regulierung der Gentranskription. Sie regulieren die Genexpression, indem sie an spezifische Sequenzen auf der DNA binden. Die Transkriptom-Sequenzierungstechnologie in Kombination mit der ChIP-seq-Technologie kann effektiv die Zielgene von Transkriptionsfaktoren identifizieren. ChIP-seq reichert die DNA-Fragmente an, die an Transkriptionsfaktoren gebunden sind, indem spezifische Antikörper verwendet werden, und sequenziert und analysiert sie dann, um die Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren im Genom zu bestimmen. In Kombination mit den durch RNA-seq bestimmten Genexpressionsdaten kann die Beziehung zwischen den Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren und der Genexpression weiter analysiert werden, um das Zielgen eines Transkriptionsfaktors zu identifizieren.

Modularität in der eukaryotischen Transkriptionsregulation (Becskei et al., 2020)

Analyse des Transkriptionsregulationsmechanismus

scRNA-seq bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für spatio-temporale Transkriptionsregulationsmechanismen. scRNA-seq kann die Transkriptionsheterogenität zwischen Zellen auf Einzelzellebene aufdecken, und kombiniert mit den räumlichen Standortinformationen von Zellen (zum Beispiel durch räumliche Transkriptomik-Technologie) können wir die räumliche Verteilung und die dynamischen Transkriptionsänderungen von Zellen in Geweben untersuchen. Zum Beispiel kann scRNA-seq in der Untersuchung des Tumormikroumfelds die Transkriptionsmerkmale verschiedener Zelluntergruppen identifizieren, wie Tumorzellen, Immunzellen und Stromazellen, die Interaktion zwischen ihnen analysieren und den zeitlichen und räumlichen Regulationsmechanismus des Auftretens, der Entwicklung und der Metastasierung von Tumoren aufdecken.

Einschränkungen und zukünftige Perspektiven der eukaryotischen Transkriptom-Sequenzierung

Eukaryotische Transkriptions- und Sequenzierungstechnologie hat die Entwicklung der biologischen Wissenschaften erheblich gefördert und die Forschung zur Regulation der Genexpression in eine neue Phase gebracht. Allerdings hat diese Technologie Einschränkungen in der Einzelzellauflösung, der quantitativen Genauigkeit von Transkripten und der Datentiefe.

Genauigkeit, Abdeckung und Kosten

Obwohl bemerkenswerte Fortschritte in der Transkriptom-Sequenzierungstechnologie erzielt wurden, stehen sie weiterhin vor Herausforderungen in Bezug auf Genauigkeit, Abdeckung und Kosten.

• In Bezug auf die Genauigkeit ist die Sequenzierungstechnologie mit kurzer Leseweite aufgrund der kurzen Leseweite anfällig für Fehler bei der Transkriptzusammenstellung und der Identifizierung von Splicing-Isomeren, insbesondere bei komplexen Genstrukturen und hochähnlichen Transkripten. Obwohl Technologien mit langen Leseweiten und langen Sequenzen die Genauigkeit der Analyse von Transkriptstrukturen verbessern können, ist ihre Sequenzierungsfehlerquote relativ hoch, sodass es notwendig ist, die Sequenzierungstechnologie und die Datenanalysemethoden weiter zu optimieren, um die Genauigkeit zu verbessern.
• Was die Abdeckung betrifft, so ist es aufgrund der Unterschiede in der Komplexität und Häufigkeit von RNA-Molekülen für die aktuelle Sequenzierungstechnologie schwierig, eine umfassende Abdeckung aller RNA-Moleküle zu erreichen. RNA-Moleküle mit niedriger Häufigkeit benötigen oft eine höhere Sequierungstiefe, um nachgewiesen zu werden, was nicht nur die Sequierungskosten erhöht, sondern auch zu unvollständigen Daten führen kann. Darüber hinaus hat die aktuelle Sequenzierungstechnologie bei einigen RNA-Molekülen mit speziellen Strukturen, wie z. B. zirkulärer RNA und hochmodifizierter RNA, immer noch einige Einschränkungen.

Validierung des Transkriptkatalogs (Yassour et al., 2009)

• Die Kosten sind ebenfalls einer der wichtigen Faktoren, die die breite Anwendung von Transkriptions- und Sequenzierungstechnologien einschränken. Vom Probenvorbereitung über das Sequenzierungsexperiment bis hin zur Datenanalyse erfordert der gesamte Prozess der Transkriptomsequenzierung viel Manpower, Materialressourcen und finanzielle Mittel. Die Senkung der Sequenzierungskosten und die Verbesserung der Sequenzeffizienz sind der Schlüssel zur Förderung der breiten Anwendung der Transkriptomsequenzierungstechnologie in der Grundlagenforschung, der klinischen Diagnostik sowie in der Arzneimittelforschung und -entwicklung.

Multiomik-Fusion

In der Zukunft wird die Integration von Multi-Omics und die KI-unterstützte Analyse eine wichtige Entwicklungsrichtung der Forschung zu eukaryotischer Transkription und Sequenzierung werden.

• Multiomics-Integration bezieht sich auf die Kombination von Transkriptomik-Daten mit anderen Omik-Daten, wie ChIP-seq, ATAC-seq, Hi-C usw., und analysiert umfassend die molekularen Mechanismen der Genexpressionsregulation aus mehreren Ebenen.
• ChIP-seq kann die Bindungsinformationen von Transkriptionsfaktoren und chromatinmodifizierenden Proteinen im Genom bereitstellen, ATAC-seq kann den offenen Zustand und die Zugänglichkeit von Chromatin aufdecken, und Hi-C kann die dreidimensionale räumliche Struktur von Chromosomen untersuchen.
• Durch die Integration dieser Daten mit Transkriptomdaten können wir ein umfassenderes Netzwerk der Genexpressionsregulation aufbauen und das komplexe Mechanismus der Gen-Transkriptionsregulation tiefgreifend verstehen.

Fazit

Als zentrales Werkzeug der funktionellen Genomforschung spielt die eukaryotische Transkriptom-Sequenzierungstechnologie eine unverzichtbare Rolle bei der Aufdeckung der Regulationsmechanismen der Genexpression und der Erforschung der Gesetze des Auftretens und der Entwicklung von Krankheiten. Durch die umfassende Anwendung von RNA-seq, CAGE-seq und anderen Sequenzierungstechnologien können Wissenschaftler wichtige biologische Prozesse wie Transkriptionsaktivität, Spleißvariationen und Promotorverwendung eingehend untersuchen, was reichhaltige Informationen und tiefgreifende Einblicke für die Lebenswissenschaften bietet.

Obwohl es weiterhin Einschränkungen in der Genauigkeit, Abdeckung und den Kosten der Transkriptions- und Sequenzierungstechnologie gibt, werden diese Probleme allmählich durch die kontinuierliche Innovation und Entwicklung der Technologie sowie die Anwendung neuer Methoden wie der Multi-Gruppen-Integration und der KI-unterstützten Analyse gelöst.

Referenzen:

1. Ogbourne S, Antalis TM. "Transkriptionale Kontrolle und die Rolle von Silencern in der transkriptionalen Regulation bei Eukaryoten." Biochem J1998 331: 1-14 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
2. Cloonan, N., Grimmond, S.M. "Transkriptom-Inhalt und -Dynamik in Einzel-Nukleotid-Auflösung." Genome Biol 2008 9: (234) Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Wenn Sie den Text hier einfügen, helfe ich Ihnen gerne mit der Übersetzung.
3. Amaia JM, Simon S., et al. "Der Entwicklungs-Transkriptionsfaktor TBX3 interagiert physisch mit dem Wnt/β-Catenin-Transkriptionskomplex in menschlichen kolorektalen Krebszellen, um Metastase-Gene zu regulieren." bioRxiv 2023 19 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text, den Sie übersetzen möchten, direkt hier ein.
4. Chen G, Ning B, Shi T. "Einzelzell-RNA-Seq-Technologien und verwandte computergestützte Datenanalyse." Front Genet2019 10:317 Es tut mir leid, aber ich kann den Inhalt von Links nicht direkt übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
5. Martin T, Fraser HB. "Vergleichende Expressionsprofilierung zeigt weit verbreitete koordinierte Evolution der Genexpression über Eukaryoten hinweg." Nat Commun2018 9(1): 4963 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder spezifischen Dokumenten übersetzen. Wenn Sie mir den Text geben, den Sie übersetzt haben möchten, helfe ich Ihnen gerne weiter.
6. Becskei A. "Feinabstimmung von Transkriptionsfaktoren für die Therapie. Moleküle." 2020 25(8): 1902 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
7. Yassour M, Kaplan T, et al. "Ab initio Konstruktion eines eukaryotischen Transkriptoms durch massiv paralleles mRNA-Sequencing." Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 106(9): 3264-9 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Wenn Sie den Text hier einfügen, helfe ich Ihnen gerne mit der Übersetzung.