Strategien zur Feinabstimmung von SNPs: Bulked Segregant Analyse

Eine großangelegte F2-Population kann genutzt werden, um Bulk-Segregationsanalyse (BSA) für die initiale Kartierung. Anschließend können innerhalb der identifizierten Kartierungsintervalle Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP)-Marker verwendet werden, um detaillierte lokale Verknüpfungskarten zu erstellen und die Kartierung von quantitativen Merkmalsloci (QTL) durchzuführen. Dieser Ansatz verbessert die Genauigkeit bei der Lokalisierung von Zielmerkmal-Loci. Darüber hinaus erleichtert die Integration von Transkriptom-Sequenzierungsdaten für die gemeinsame Analyse die beschleunigte Identifizierung von Kandidatengen. Diese Methodik wird voraussichtlich als führende Strategie für die Fein-Kartierung in der absehbaren Zukunft dominieren.

Grundlegende Prinzipien der Bulked Segregant Analyse (BSA)

BSA, auch bekannt als Mischpoolanalyse oder segregierende Populationspoolanalyse, ist ein methodischer Ansatz, der darin besteht, Individuen mit extremen oder repräsentativen Phänotypen aus einer Population auszuwählen, um Mischpools für die Analyse zu erstellen. Durch die Untersuchung der Unterschiede in den Allel- oder molekularen Markerhäufigkeiten zwischen diesen Mischpools können Loci, die mit bestimmten Merkmalen assoziiert sind, im Genom kartiert werden.

Im Vergleich zu traditionellen genetischen Forschungsmethoden hat BSA einen bemerkenswerten Vorteil: Es entfällt die Notwendigkeit, alle Individuen innerhalb einer Population zu genotypisieren. Stattdessen konzentriert es sich auf die Analyse von gepoolten Proben ausgewählter Individuen basierend auf ihren phänotypischen Eigenschaften. Dieser Ansatz reduziert erheblich die Arbeitsbelastung und die Kosten, die mit der Studie verbunden sind. Zum Beispiel kann in einer Population von 500 Individuen die Genotypisierung von nur zwei Elternpools und zwei Nachkommenpools ausreichen, um eine BSA-Analyse abzuschließen (und sogar nur die Nachkommenpools allein können die BSA-Analyse in Abwesenheit von Elternpools erleichtern). Darüber hinaus ist, vorausgesetzt das experimentelle Design ist solide, die statistische Zuverlässigkeit der BSA-Analyse mit Methoden vergleichbar, die die Untersuchung aller individuellen Proben beinhalten.

Darüber hinaus ist BSA nicht ausschließlich auf Sequenzierungstechnologien angewiesen. Es kann unter Verwendung von molekularen Markern, Mikroarrays und Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden über verschiedene biologische Ebenen hinweg, einschließlich DNA, RNA und Proteinen, eingesetzt werden. Allerdings sind bis jetzt umfassende BSA-Methoden auf Proteinebene noch nicht vollständig etabliert. Folglich konzentrieren sich BSA-Analysen überwiegend auf die DNA- und RNA-Ebenen.

Einführung in die Bulk-Segregant-Analyse-Sequenzierung

Einheitlichkeit der Pools

Für BSA ist es entscheidend, eine Gleichmäßigkeit innerhalb des Pools sicherzustellen. Diese Gleichmäßigkeit bedeutet, dass die sequenzierte DNA gleichmäßig aus jedem Individuum stammen sollte. Daher wird empfohlen, zunächst die Nukleinsäuren aus jedem Individuum zu extrahieren und diese Extrakte dann zu einem Pool zu kombinieren, anstatt die Proben vor der Nukleinsäureextraktion zu mischen.

Poolgröße und Sequenzierungstiefe

Die Größe des Pools und die Sequenzierungstiefe sind beide entscheidende Faktoren, die die Präzision der Lokus-Kartierung beeinflussen. Eine Erhöhung der Poolgröße oder der Sequenzierungstiefe verbessert in der Regel die Genauigkeit der Lokalisierung. Allerdings führen darüber hinausgehende Erhöhungen der Poolgröße und Sequenzierungstiefe zu abnehmenden Erträgen hinsichtlich der verbesserten Lokalisierungsgenauigkeit. Für konventionelle F2-Populationen ist es typischerweise notwendig, mehr als 30 Individuen pro Pool einzuschließen, mit einer Sequenzierungstiefe von 20× für die elterlichen Sequenzen und 1× pro Individuum für die Nachkommen-Pools.

Extreme Eigenschaften

Bei einer festen Populationsgröße muss die Größe des Pools angemessen begrenzt werden, um sicherzustellen, dass der Pool spezifische extreme Merkmale genau repräsentiert. Wenn die ausgewählten Merkmale nicht ausreichend extrem sind, kann dies zu einer erfolglosen Lokalisierung führen. Um die Genauigkeit der Lokalisierung durch Erhöhung der Poolgröße zu verbessern, ist es notwendig, gleichzeitig die Gesamtpopulation zu vergrößern. Es ist unerlässlich, das Mischen von Individuen aus verschiedenen Populationen mit ähnlichen Phänotypen für die BSA-Analyse zu vermeiden.

Bulked Segregant Analyse Workflow

Bevölkerungsbau: F1-, F2- und BC1F1-Populationen wurden etabliert.

Quantitative Trait Locus (QTL) KartierungQTLs werden in der F2-Population kartiert. Die Validierung der QTL-Kartierungsergebnisse erfolgt mithilfe von F2:3-Nachkommenlinien.

QTL-SegregationMolekulare Marker werden verwendet, um Ziel-QTLs auszuwählen, die heterozygot sind. BC1F1-Einzelpflanzen werden identifiziert, bei denen andere QTLs homozygot sind (eine ausreichende Anzahl von BC1F1-Individuen ist erforderlich). Die anschließende Selbstbestäubung führt zu BC1F1:2-Nachkommenlinien.

Extreme PhänotypauswahlZwei extreme Phänotypgruppen werden aus der BC1F1:2-Population ausgewählt.

Extreme Phänotyp-PoolingDNA wird aus den ausgewählten extremen Phänotypgruppen extrahiert und zu zwei extremen Pools zusammengeführt.

Sequenzierung und VariantenaufrufDie Sequenzierung wird an den beiden gepoolten Proben durchgeführt. Varianten werden identifiziert, indem die Sequenzierungsdaten gegen ein Referenzgenom ausgerichtet werden.

AssoziationsanalyseDie SNP-Index-Analyse wird durchgeführt (Takagi H, et al., 2013; Mansfeld BN, et al., 2018).

Für weitere Informationen zum Arbeitsablauf siehe das „BSA-seq-Technologie-Workflow"

Fallstudie: Schnelle Kartierung von QTL für die Pflanzenhöhe von Mais

Ein Mais Bevölkerungsstudie wurde durchgeführt, um QTLs zu identifizieren, die mit der Pflanzenhöhe assoziiert sind. Mit vier Generationen von Maismaterialien wurde eine segregierende F2-Population aus zwei inbreds Linien, HZS und 1462, geschaffen, die signifikante Höhenunterschiede aufweisen. Der Bereich der individuellen Pflanzenhöhen in der F2-Population variierte von 199 cm bis 307 cm, was auf ein stark segregierendes Merkmal hinweist und die Beteiligung mehrerer QTLs an der Kontrolle der Pflanzenhöhe nahelegt.

Methodik

Bevölkerungsaufbau:

Die F2 segregierende Population wurde aus den beiden inbred Linien HZS und 1462 entwickelt.

QTL-Kartierung:

Insgesamt wurden 1.028 polymorphe Marker verwendet, um QTLs mit großem Effekt zu identifizieren. Vier QTLs wurden auf den Chromosomen 1, 3, 6 und 7 kartiert, wobei die erklärte phänotypische Variation (PVE) zwischen 7 % und 17 % lag. Die Ergebnisse der QTL-Kartierung wurden mit F2:3-Nachkommenlinien validiert.

Feinabstimmung von qPH7:

Das auf Chromosom 7 gelegene QTL, bezeichnet als qPH7, wurde einer Feinkartierung mittels einer QTL-seq-Strategie unterzogen. Aus 813 BC1F1-Einzelpflanzen (heterozygot für qPH7 und homozygot für die anderen drei QTL-Loci) wurden 15 Pflanzen ausgewählt, und BC1F1:2 Nachkommenlinien wurden erzeugt. Die Pflanzenhöhe wurde bewertet, was zu 3.120 BC1F1:2 Einzelpflanzen führte. Diese wurden in zwei extreme Phänotypgruppen unterteilt: Niedrigwert (580 Pflanzen) und Hochwert (567 Pflanzen). DNA aus diesen Gruppen wurde jeweils in niedrige und hohe Pools zusammengefasst.

Genomweite Sequenzierung:

Whole-Genome-Sequenzierung wurde an den gepoolten Proben (Abdeckung > 280×) durchgeführt, wobei 197.021 hochqualitative SNPs nachgewiesen wurden. Die Marker-Genotypisierung bestätigte den Spitzenstandort zwischen 135,1 und 135,2 Mb. Die Analyse mit den Algorithmen smoothLOD und ED4 ergab einen einzelnen Peak auf Chromosom 7, der bei 135,3 Mb lokalisiert ist.

Identifizierung von Kandidatengenen

Um weitere Kandidatengene zu identifizieren, RNA-Seq-Analyse Es wurde durchgeführt. Die Analyse der differentiellen Expression zeigte, dass Zm00001d020874 eine signifikante differentielle Expression zwischen dem Sprossapikalmeristem (SAM) und den juvenilen Internodiengeweben der Elternlinien aufwies. Basierend auf funktionalen Homologen in Arabidopsis und dem smoothLOD-Mapping-Signal wird Zm00001d020874 als Kandidatengen für qPH7 betrachtet. Nachfolgende Experimente, einschließlich CRISPR-Gen-Knockout und Protein-Interaktionsassays, unterstützen die Rolle von Zm00001d020874 als Gen, das die Pflanzenhöhe steuert.

Fazit

Die Studie zeigt einen effektiven Ansatz zur schnellen Kartierung von QTLs, die mit der Pflanzenhöhe von Mais assoziiert sind, und zur Identifizierung von Kandidatengenen durch eine Kombination aus QTL-seq und RNA-seq Analysen. Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der genetischen Kontrolle der Pflanzenhöhe bei und bieten eine Grundlage für weitere funktionale Validierungen.

Überlegungen und Herausforderungen

Technische Herausforderungen bei der Hybrid-Kartierung von Mutanten und Wildtyp

Während des Prozesses der Kartierung von Intervallen mit Mutanten und Wildtyp-Hybriden können bestimmte technische Herausforderungen auftreten. Daher sollte dieser Ansatz mit Vorsicht angewendet oder, wenn möglich, vermieden werden aufgrund dieser Komplexitäten.

Überlegungen zur BSA und Kandidatengen-Mapierung

Bei der Anwendung von BSA oder anderen Präzisionstechniken zur Lokalisierung von Kandidatengen ist es wichtig zu beachten, dass das Fehlen von Polymorphismus zwischen den Elternlinien in einem bestimmten Bereich nicht unbedingt auf ein falsch positives Ergebnis im kartierten Intervall hinweist. Die molekularen Regulationsmechanismen, die der phänotypischen Variation zwischen Arten zugrunde liegen, sind komplex und vielschichtig. Solche Variationen können auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, einschließlich SNPs, InDels, Exonmutationen oder Variationen in Promotorregionen.

Es ist eine häufige Herausforderung in der Genkartierung und Klonierungsstudien, auf Szenarien zu stoßen, in denen die erwarteten Polymorphismen nicht offensichtlich sind. Es gibt jedoch Fälle, in denen die DNA-Methylierung als kritischer Regulationsmechanismus dient. Zum Beispiel induzieren während des Prozesses der Vernalisation niedrige Temperaturen Veränderungen in den DNA-Methylierungszuständen, die wiederum die Expression des FLOWERING LOCUS C (FLC) Gens regulieren und letztendlich den Blühprozess bei Pflanzen beeinflussen (Sheldon et al., 2000; Berry et al., 2015).

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Referenz:

1. Zhang H, Wang X, Pan Q, Li P, Liu Y, Lu X, Zhong W, Li M, Han L, Li J, Wang P, Li D, Liu Y, Li Q, Yang F, Zhang YM, Wang G, Li L. QTG-Seq beschleunigt die feine Kartierung von QTL durch QTL-Partitionierung und Ganzgenomsequenzierung von gebündelten segregierenden Proben. Mol-Anlage2019, 4. März; 12(3):426-437.