Sequenzierungstechnologien für den Hotspot der mikrobiellen Epigenomik – DNA N6-Methyladenin

Die am häufigsten vorkommende modifizierte Base in bakterieller DNA ist N6-Methyladenin und umfasst Funktionen bei der Regulierung von Modifikationsprozessen (RM), der Reparatur von neuem DNA-Strang und der Kontrolle der Genexpression. Virulenz und Beziehungen zwischen Bakterien und Wirtszellen können durch Mutationen in Methyltransferasen und Überexpression verursacht werden. Keine Enzyme sind in der Lage, m6A-DNA zu demethylieren. in vivo, aber die wettbewerbsfähige Proteinbindung an Zielorten kann die Methylierung beeinflussen und somit die Transkription in neu replizierten Zellen modifizieren. Leserastermutationen könnten auch zu Fortschritten in der Genexpression führen, die an der Zellwandbildung beteiligt sind, und die Wege in Wiederholungsregionen der Methyltransferase-Gene wiederherstellen. Diese Mechanismen der Schrittvariation können Bakterien helfen, die Abwehrmechanismen von Säugetierwirten zu umgehen, aber es ist noch unklar, ob Leserastermutationen der Methyltransferase zu einer Toleranz gegenüber anderen Bedingungen führen.

Vor dem Aufkommen der Einzelmolekül-Sequenzierung wurden Restriktionsverdau oder Sequenzierung nach Immunpräzipitation in Techniken verwendet, um m6A in DNA zu bewerten. Ein Test wird verwendet, um die Kinetik der DNA-Polymerase zu unterscheiden, die methylierte Basen und Vorlagen für unmethylierte Basen umfasst, berechnet als Inter-Puls-Zeit (IPD) in die Einzelmolekül-, Echtzeit- (SMRT) Analyse Pipeline für PacBio-Sequenzierungsergebnisse. Verschiedene Gruppen haben auch gezeigt, dass geringfügige Verbesserungen der elektrischen Impulse, während DNA durch Nanoporen hindurchgeht, das Vorhandensein von Basismodifikationen mit Sequenziergeräten aufzeigen werden, die von Oxford Nanopore Technologien (ONT).

Techniken zur Sequenzierung von N6-Methyladenin

SMRT-SequenzierungDie SMRT-Sequenzierung von PacBio basiert auf der Sequenzierung durch Synthese, bei der die Sequenz eines zirkulären DNA-Templates aus einer Reihe von Fluoreszenzimpulsen bestimmt wird, die jeweils von einer Polymerase erzeugt werden, die am Boden eines Wells fixiert ist und ein benanntes Nukleotid hinzufügt. Daher ändern sich Basenänderungen nicht die als Basis gekennzeichnete Sequenz, sondern sie verändern die Kinetik der Polymerase. Basenänderungen können durch den Vergleich eines veränderten Prototyps mit einem in silico-Modell oder einem unveränderten Prototyp abgeleitet werden, indem die Interimpuls-Längen bewertet werden. Zum Beispiel scheint das Vorhandensein von 6mA im Template-Strang die Integration des komplementären T zu behindern. Kinetische Störungsmuster können komplizierter und kontextabhängig sein, während die Basenanpassung oft von der Schwere der Störungen abhängt. Diese Merkmale ermöglichen es der SMRT, 4mC und 6mA am empfindlichsten zu erkennen, was sie für die bakterielle Epigenomik nützlich macht. Die SMRT-Sequenzierung hat seit 2012 die Anzahl der identifizierten Methyltransferasen erheblich erhöht. Die SMRT-Sequenzierung wurde auch in Leishmania verwendet, um Base J (β-d-Glucosyl-Hydroxymethyluracil) zu diagnostizieren, und hat die Fähigkeit, unerklärte Verbesserungen zu analysieren.

Nanoporen-SequenzierungWenn eine einzelsträngige Nukleinsäure entlanggezogen wird, testet die ONT-Nanoporen-Sequenzierung den Unterschied des ionischen Stroms durch eine biologische Nanopore. In einer Methode, die als Base-Calling bezeichnet wird, wandeln neuronale Netzwerke die vorhandene Spur in Nukleotide um. DNA-Modifikationen auf der Basisebene fügen Rohsignalsanomalien hinzu und machen sie beobachtbar. Nanopolish ist ein Software-Kit zur Signalniveauanalyse für Oxford Nanopore-Sequenzierungsdaten, das 5mCG mit einem vortrainierten Algorithmus identifizieren kann. Da Nanopolish ein 5mCG-Modell kombiniert, zusätzlich zur gezielten Probe, ist es nicht notwendig, eine PCR-amplifizierte, unveränderte Einheit zu sequenzieren. Bei einer Einzel-Lesevorgang, nahezu auf Einzel-Nukleotid-Auflösung, generiert Nanopolish die Wahrscheinlichkeit, dass eine Base verändert ist.

Drei Maßnahmen sind an der Identifizierung von Basismodifikationen bei der Nanoporen-Sequenzierung beteiligt: (1) die Basiserkennung mit kanonischen Basen, (2) das Anheften des Rohsignals an einen genetischen Referenz, und (3) die Bewertung des Beweises, dass eine Base verändert ist. Bisher schneidet die Nanoporen-Sequenzierung bei der Erkennung von 5mCG besser ab, während die Präzision von m6A mit der von PacBio vergleichbar ist. Im Vergleich zu SMRT macht die reduzierte Kosten pro Gb es ideal für größere Genome.

Referenzen:

1. O'Brown, Z.K., Boulias, K., Wang, J. u. a. Quellen von Artefakten in Messungen von 6mA und 4mC Häufigkeit in eukaryotischer genomischer DNA. BMC Genomics. 2019, 20, 445.
2. Quentin Gouil, Andrew Keniry; Neueste Techniken zur Untersuchung der DNA-Methylierung. Essays Biochemie. 2019, 63 (6): 639–648.
3. Chuan-Le Xiao, u. a. Einzel-Nukleotid-Auflösungs-Sequenzierung von menschlichem N6-Methyl-Deoxyadenosin zeigt strangsymmetrische Cluster, die mit SSBP1 im mitochondrialen Genom assoziiert sind, 2018.