DNA 6mA Sequenzierung

Als erfahrene Anbieter von Next-Generation Sequencing (NGS) und Dienstleistungen zur Sequenzierung der dritten Generation liegt unser Engagement darin, unvergleichliche Mengen an Sequenzierungsdaten bereitzustellen, um schnelle und innovative Analysemethoden zu unterstützen, während wir gleichzeitig kostengünstige Lösungen anbieten. Tiefgreifend versiert im Bereich der DNA-6mA-Sequenzierung nutzen wir modernste Hochdurchsatz-Sequenzer, sorgfältige Sequenzierungsmethoden und ausgeklügelte Bioinformatikanalyse Wege, um unseren Kunden garantierte und unparteiische Dienstleistungen anzubieten.

Die Einführung der DNA 6mA-Sequenzierung

DNA-Methylierung wird als epigenetisches Merkmal in verschiedenen wichtigen Prozessen in Eukaryoten angesehen. 5-Methylcytosin (5mC) ist die am häufigsten vorkommende DNA-Methylierungsmodifikation in Eukaryoten und wurde als das am besten charakterisierte epigenetische Marker anerkannt. N6-Methyladenin (6mA) wurde früher nur in Prokaryoten, einzelligen Eukaryoten und Pflanzen vermutet. In den letzten Jahren wurde 6mA in DNA als ein weiteres wichtiges epigenetisches und epitranskriptomisches Marker in höheren Eukaryoten definiert. Ein signifikanter Rückgang der 6mA-Spiegel wurde auch in einer Vielzahl von Krebszellen berichtet (unveröffentlichte Daten).

CD Genomics verwendet mehrere Strategien, um den genomweiten Methylierungsstatus und die Häufigkeit einzelner 6mA-Stellen zu validieren. Long-Read-Sequenzierung, die von Pacbio Und Nonapore kann verwendet werden, um 6mA in verschiedenen Genomen nachzuweisen. 6mA DNA-Immunpräzipitation gefolgt von Deep-Sequencing (DIP-Seq) ist ein weiteres wichtiges Werkzeug, um Regionen im Genom zu identifizieren, die 6mA enthalten.

Methoden zur Detektion von 6mA-DNA

Im Bereich der 6mA-Detektion stechen mehrere Methoden hervor:

6mA-IPseq: Dieses Verfahren umfasst die Immunpräzipitation von methylierten DNA-Fragmenten unter Verwendung von 6mA-Antikörpern, gefolgt von einer Sequenzierung. Es ist kostengünstig, weist jedoch aufgrund der Einschränkungen der Antikörper und möglicher falsch positiver Ergebnisse von unmethyliertem DNA und RNA-Interferenz eine ungenaue Lokalisierung der Methylierungsstellen auf.

6mA-REseq: Basierend auf der Verdauung von ungemethylisierten Motiven durch Restriktionsenzyme bewertet diese Methode den Methylierungsstatus anhand des Verhältnisses von internen zu terminalen Motiven. Sie ist durch spezifische Restriktionsstellen und potenzielle falsch-positive Ergebnisse aufgrund unvollständiger Verdauung eingeschränkt.

HPLC-MS/MS: Die hochleistungsfähige Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie bietet eine außergewöhnliche Sensitivität und Spezifität bei der Identifizierung von 6mA. Dieses Verfahren ermöglicht eine präzise Quantifizierung von Nukleosiden; es ist jedoch anfällig für Störungen durch bakterielle Kontamination, was strenge experimentelle Kontrollen erforderlich macht.

SMRT: Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung nutzt DNA-Polymerasen und fluoreszenzmarkierte Nukleotide, um 6mA-Modifikationen direkt nachzuweisen. Obwohl es beträchtliche Leistungsfähigkeit bietet, ist es anfällig für erhöhte falsch-positive Raten, insbesondere in Szenarien mit niedrigen 6mA-Konzentrationen. Darüber hinaus fehlt die Fähigkeit, zwischen 6mA- und 1mA-Modifikationen zu unterscheiden.

Deep Learning Vorhersagemodelle: Verschiedene Deep-Learning-Modelle sind zur Vorhersage von 6mA-Stellen entstanden, zum Beispiel DNA6mA-MINT, i6mA-stack, Deep6mA und andere. Diese Modelle weisen eine beeindruckende Genauigkeit auf; jedoch könnte ihre Anwendbarkeit über verschiedene Arten hinweg eingeschränkt sein, was fortlaufende Optimierungsbemühungen erforderlich macht.

Abbildung 1. Nachweismethoden von 6 mA. (A) 6 mA-IPseq und 6 mA-REseq. (B) HPLC-MS/MS. (C) SMRT. (D) Vorhersagemodell mit Deep Learning. (Li et al., 2022)

Vorteile der DNA 6mA-Sequenzierung

• Dekodierung von Methylierungsmustern der genomischen DNA: 6mA ist eine entscheidende Modifikation in der genomischen DNA, die an der Regulation der Genexpression und der genomischen Stabilität beteiligt ist. Die Sequenzierung von 6mA bietet Einblicke in sein Verteilungsmuster, die Modifikationsniveaus und seine Assoziation mit biologischen Prozessen, wodurch unser Verständnis seiner Funktion und Bedeutung vorangetrieben wird.
• Hochauflösende und vollständige Genomabdeckung: Die Sequenzierungstechnologie der dritten Generation ermöglicht die direkte Sequenzierung einzelner DNA-Moleküle und bietet eine höhere Auflösung als traditionelle Methoden. Zweitgeneration-SequenzierungFolglich ermöglicht es die genaue Erkennung der 6mA-Verteilung und bietet uneingeschränkten Zugang zum gesamten Genom, was die Erkennung von 6mA im gesamten Genom ermöglicht.
• Hohe Sensitivität und Spezifität: Die Sequenzierung der dritten Generation bietet außergewöhnliche Sensitivität und Spezifität, die eine präzise Erkennung von 6mA-Modifikationen ermöglicht und gleichzeitig andere verwandte Modifikationen unterscheidet. Diese Fähigkeit erleichtert die effiziente Anreicherung und Erkennung von 6mA und fördert somit ein tieferes Verständnis seiner biologischen Funktion und Bedeutung.
• Erfassung von Langstreckeninformationen: Die Fähigkeit der Sequenzierung der dritten Generation, größere DNA-Fragmente in einem einzigen Lesevorgang zu erfassen, verbessert unser Verständnis der Langstreckeninteraktionen und regulatorischen Mechanismen von 6mA auf genomischer Ebene.
• Effiziente Anreicherung und Detektion: Die 6mA DIP-Seq-Technik nutzt die Spezifität von 6mA-Antikörpern, um methyliertes DNA-Material anzureichern und es mit Hilfe von Deep-Sequencing-Technologie zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Anreicherung und Detektion von 6mA und erlaubt eine präzise Bestimmung seiner Loci und Verteilungsmuster.
• Kosten-Effektivität: Im Vergleich zu anderen vergleichbaren Methoden erweist sich 6mA DIP-Seq als kostengünstiger, was es zu einer wirtschaftlich tragfähigen Wahl macht, insbesondere für großangelegte 6mA-Sequenzierungsprojekte oder solche mit Budgetbeschränkungen.
• Benutzerfreundlichkeit: Das relativ vereinfachte und unkomplizierte Verfahren der 6mA DIP-Seq beseitigt die Notwendigkeit komplexer Vorverarbeitungsschritte, was es Forschern zugänglicher macht und gleichzeitig zuverlässige 6mA-Sequenzierungsdaten in einem kürzeren Zeitrahmen gewährleistet.

Anwendung der DNA 6mA-Sequenzierung

Epigenetische Regulationsstudien: Die Nutzung der DNA-6mA-Sequenzierung hat sich als entscheidend erwiesen, um die komplexe epigenetische Landschaft von Organismen zu entschlüsseln. Diese fortschrittliche Methode identifiziert 6mA-Modifikationsstellen im gesamten Genom, ein entscheidender Schritt zur Aufdeckung ihrer Verteilungsmuster und zeitlichen Dynamiken. Unser Verständnis darüber, wie 6mA-Modifikationen als regulatorische Elemente in der Genexpression, der Chromatin-Konformation und breiteren epigenetischen Mechanismen fungieren, ist entscheidend für das Verständnis der komplexen Mechanismen, die verschiedene zelluläre Aktivitäten und Entwicklungsverläufe steuern.

Erforschung von Krankheitsmechanismen: Störungen in DNA-6mA-Modifikationen werden zunehmend mit der Pathologie einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter insbesondere Krebs, neurologische Dysfunktionen und Stoffwechselstörungen. Die Stärke der DNA-6mA-Sequenzierung liegt in ihrer Fähigkeit, informierte Vergleiche zwischen pathologischen und gesunden Geweben zu ermöglichen, wodurch verschiedene 6mA-Modifikationsmuster identifiziert werden, die die betroffenen Krankheitszustände widerspiegeln. Solche aufschlussreichen Ergebnisse beschleunigen die Identifizierung diagnostischer Biomarker und möglicher therapeutischer Ziele und bieten letztendlich innovative Ansätze für weitere Bemühungen zur Krankheitsprävention und -kontrolle.

Forschung in der Entwicklungsbiologie: DNA N6-Methyladenin (6mA) Modifikationen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Gewebedifferenzierung und Organogenese. Die Anwendung der DNA 6mA-Sequenzierung ermöglicht es Wissenschaftlern, dynamische Veränderungen in der 6mA-Verteilung über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg zu katalogisieren, wodurch unser Verständnis der epigenetischen Kontrolle von Entwicklungsübergängen bereichert wird. Das Entwirren der Schnittstellen zwischen 6mA-Modifikationen und Genexpressionsprofilen kann Licht auf die molekularen Mechanismen werfen, die das Wachstum von Organismen und komplexe morphogenetische Ereignisse steuern.

Studien zu Umweltreaktionen: Umweltstimuli können die Landschaft der DNA-6mA-Modifikationen beeinflussen und zur adaptiven Reaktion eines Organismus beitragen. Der Einsatz von DNA-6mA-Sequenzierung ermöglicht die Kartierung von umweltbedingt induzierten Veränderungen im 6mA-Profil und verdeutlicht somit die adaptiven Rollen dieser epigenetischen Modifikationen als Reaktion auf Umweltstörungen. Ein umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen, die diesen Reaktionen zugrunde liegen, erweitert nicht nur unser Verständnis der Umweltanpassung, sondern kann auch Einblicke in die Resilienz verschiedener biologischer Systeme geben.

Mikrobiom-Untersuchung: DNA N6-Methyladenin (6mA) Modifikationen spielen eine entscheidende Rolle in den physiologischen Dynamiken, der Pathogenität und den Wirt-Interaktionen von Mikroben. Die DNA 6mA-Sequenzierung ermöglicht die umfassende Profilierung dieser 6mA-Modifikationen innerhalb mikrobieller Genome und unterstützt somit die Erforschung der mikrobiellen epigenetischen Regulation und deren Auswirkungen auf das Verhalten und die Ökologie von Mikroben. Durch das Verständnis der Funktion von 6mA-Modifikationen in der Anpassungsfähigkeit und Pathogenese von Mikroben haben Forscher das Potenzial, innovative Ansätze zur Kontrolle von Infektionskrankheiten und zur Manipulation mikrobieller Populationen zu entwickeln.

DNA 6mA Sequenzierungs-Workflow

Die DNA 6mA-Sequenzierung, ein entscheidendes Werkzeug in der epigenetischen Forschung, umfasst mehrere wichtige Schritte, um N6-Methyladenin (6mA)-Modifikationen in genomischer DNA genau zu identifizieren und zu analysieren. Im Folgenden ist ein typischer Workflow für die DNA 6mA-Sequenzierung aufgeführt:

Dienstspezifikationen

Unsere Methoden zur Sequenzierung von DNA 6mA

Langzeit-Sequenzierung hat erheblich dazu beigetragen, die genomweite Verteilung von 6mA zu identifizieren und kann eine Auflösung auf Einzel-Nukleotid-Ebene erreichen. Da die absolute Häufigkeit von 6mA relativ niedrig ist, ist eine ausreichende Abdeckung von über 100x erforderlich. SMRT-Sequenzierung ermöglicht die direkte Erkennung von modifizierten Nukleotiden in der DNA-Vorlage, einschließlich 6mA, 5mCund 5-Hydroxymethylcytosin, und beeinträchtigt nicht die Bestimmung der primären DNA-Sequenz. Basismodifikationen (6mA) werden mithilfe von RS-Modifikation und Motivanalyse identifiziert.

Abbildung 2. Gleichzeitige Erfassung von Daten einschließlich DNA-Modifikationen.

6mA DNA-Immunpräzipitation gefolgt von Deep Sequencing (6mA DIP-Seq) wurde aus bestehenden Ansätzen zur Erkennung von Adenosin-Methylierung in RNA entwickelt. Wir haben dieses Protokoll entwickelt und es zur Erkennung von 6mA in DNA angepasst. In diesem Protokoll wird genomische DNA extrahiert, fragmentiert und dann DNA, die 6mA enthält, mit einem Antikörper, der 6mA in genomischer DNA erkennt, isoliert. Nach anschließenden Waschschritten werden DNA-Fragmente, die kein 6mA enthalten, eliminiert, und die 6mA-haltigen Fragmente werden vom Antikörper eluiert, um sie weiter für nachfolgende Analysen zu verarbeiten.

Abbildung 3. Darstellung der 6mA DNA-Immunpräzipitation.

	Musteranforderungen Langzeit-Sequenzierung: Es werden mindestens 10 μg HMW-DNA benötigt. 6mA DIP-Seq: Es sind mindestens 5 μg gDNA erforderlich. DIN-Wert ≥ 7,0.
	Sequenzierung PacBio SMRT-Plattform NovaSeq6000, PE150 20-30M saubere Reads
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Identifizierung von DNA-Methylierungsanreicherungspeaks Identifizierung von 6mA-Stellen Annotation von DNA-Methylierungsanreicherungspeaks Identifikation und Annotation von DMRs GO- und Pfadanalyse von differentiell methylierten DNA-Regionen Visualisierung der DNA-Methylierung … (mehr auf Anfrage)

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in DNA 6mA-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenzen:

1. Koziol MJ, et al. Identifizierung von Methylierter Deoxyadenosinen in genomischer DNA durch dA6m DNA-Immunpräzipitation. Bio Protokoll2016, 5. November; 6(21).
2. Chuan-Le Xiao et al. Sequenzierung mit Einzel-Nukleotid-Auflösung von menschlichem N6-Methyl-Deoxyadenosin zeigt strand-asymmetrische Cluster, die mit SSBP1 im mitochondrialen Genom assoziiert sind. Nukleinsäuren Forschungen2018, 14. Dez;46(22):11659-11670.
3. Li H, Zhang N, Wang Y, et al. DNA N6-Methyladenin-Modifikation im eukaryotischen Genom. Grenzen der Genetik, 2022, 13: 914404.
4. Li X, Zhang Z, Luo X u. a. Die Erforschung der N6-Deoxyadenosin-Methylierung in Säugetiergenomen. Protein & Zelle, 2021, 12(10): 756-768.

Beispiele für Teillieferdiagramme:

1. Was sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Erkennung von DNA 6mA?

Die häufig verwendeten Methoden zur Detektion von DNA 6mA umfassen ein Spektrum von Techniken, darunter Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), antikörperabhängige Assays wie Immunoblotting und Immunfluoreszenz (IF), Immunpräzipitation in Kombination mit Sequenzierung (DIP-seq) und nicht-antikörperabhängige Ansätze.

LC-MS/MS zeichnet sich durch seine bemerkenswerte Empfindlichkeit und Spezifität aus, die eine präzise Quantifizierung von DNA 6mA ermöglicht, mit einer Empfindlichkeit von bis zu eins zu zehn Millionen. Dieses Verfahren unterscheidet treffend zwischen DNA 6mA und RNA m6A oder andere DNA-Modifikationen. Eine sorgfältige Probenvorbereitung ist jedoch unerlässlich, um potenzielle Kontaminationen, insbesondere durch Bakterien, zu beseitigen, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten.

Antikörperabhängige Techniken, wie Immunoblotting und Immunfluoreszenz, sind zwar weniger empfindlich im Vergleich zu LC-MS/MS, bieten jedoch Einfachheit und weitreichende Anwendbarkeit bei der Untersuchung von 6mA. Dennoch fehlt es den aktuellen Antikörpern an der Unterscheidung zwischen DNA 6mA und RNA m6A oder m6Am, was eine gründliche Entfernung von RNA-Kontaminationen erforderlich macht, um fehlerhafte Ergebnisse zu vermeiden.

DIP-seq erweist sich als ein robustes Verfahren, das Immunpräzipitation mit Sequenzierung kombiniert und die präzise Erkennung und Quantifizierung der 6mA-Verteilung im gesamten Genom ermöglicht. Dennoch ist die Optimierung der Antikörperspezifität für individuelle experimentelle Systeme von größter Bedeutung, während die Häufigkeit von 6mA eine entscheidende Rolle bei der erfolgreichen Anreicherung spielt.

Nicht-antikörperabhängige Methoden spielen eine entscheidende Rolle bei der Validierung antikörperabhängiger Ergebnisse und der Minderung unspezifischer Signale. Eine solche Methode besteht in der Verwendung von methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen zum Schneiden von DNA, wobei ihre Abhängigkeit von spezifischen DNA-Motiven ihre Vielseitigkeit einschränkt. Ein weiterer vielversprechender Ansatz ist das Sequenzieren der dritten Generation, exemplifiziert durch SMRT-seq, das die kinetischen Eigenschaften der DNA-Polymerase während der Replikation nutzt, um 6mA nachzuweisen. Während SMRT-seq sich als erfolgreich bei der Detektion von 6mA in Säugetieren und Pflanzen erwiesen hat, ergeben sich Herausforderungen durch die niedrige Häufigkeit von 6mA, die eine Anreicherung und eine robuste Sequenzierungsabdeckung erfordert.

2. Welche Organismen enthalten 6mA?

Das epigenetische Merkmal N6-Methyladenin (6mA) ist ubiquitär in verschiedenen Lebensformen verbreitet, am häufigsten in Prokaryoten, jedoch auch in bestimmten eukaryotischen Arten nachgewiesen. Hier skizzieren wir einige Organismen, die für das Vorhandensein von 6mA-Modifikationen anerkannt sind:

Im Bereich der Prokaryoten stellen 6mA-Modifikationen eine vorherrschende Form der DNA-Modifikation dar, die in verschiedenen Bakterienarten wie Escherichia coli und Clostridium perfringens sowie in Untergruppen des Archaea-Phylums weit verbreitet ist, einschließlich Methanobacterium und Sulfolobus solfataricus.

Die Aufmerksamkeit auf Eukaryoten gerichtet, wurde die Entdeckung von 6mA-Modifikationen in diesem Bereich etwas hinausgezögert, doch aktuelle Studien haben deren Existenz in ausgewählten Organismen bestätigt:

• Hefe: Bestimmte Hefespezies, wie Saccharomyces cerevisiae, sind dafür bekannt, 6mA-Modifikationen aufzuweisen.
• Nematoden: Der eukaryotische Organismus Caenorhabditis elegans weist 6mA-Modifikationen auf.
• Fruchtfliegen: Hinweise deuten auf das Vorhandensein von 6mA-Modifikationen im Genom von Drosophila melanogaster hin.
• Pflanzen: Verschiedene Pflanzen, wie Arabidopsis thaliana, zeigen 6mA-Modifikationen.

Im Einklang mit den Fortschritten in der Sequenzierungstechnologie intensiviert sich die Untersuchung von 6mA-Modifikationen über ein breiteres Spektrum eukaryotischer Organismen. Es wird erwartet, dass zukünftige Entdeckungen die Liste der Organismen, von denen bekannt ist, dass sie 6mA-Modifikationen aufweisen, weiter erweitern werden.

3. Wie funktioniert die DNA-6mA-Sequenzierung?

Die 6mA-Sequenzierung von DNA umfasst typischerweise mehrere Schritte: DNA-Extraktion, Fragmentierung, Anreicherung von 6mA-modifizierten DNA-Fragmenten, Bibliotheksvorbereitung, Hochdurchsatz-Sequenzierungund computergestützte Analyse. Verschiedene Anreicherungsmethoden, wie antikörperbasierte Immunpräzipitation oder chemische Markierung, können eingesetzt werden, um 6mA-modifizierte DNA-Fragmente selektiv vor der Sequenzierung zu erfassen.

4. Wie werden DNA 6mA-Sequenzierungsdaten entschlüsselt?

Die Analyse von DNA 6mA-Sequenzierungsdaten umfasst in der Regel die vorläufige Verarbeitung von Rohsequenzierungsdaten, die Ausrichtung an das Referenzgenom, die Identifizierung von 6mA-Modifikationsorten, den differenziellen Vergleich zwischen experimentellen Bedingungen und die funktionale Annotation von 6mA-spezifischen Regionen. Zahlreiche bioinformatische Werkzeuge und Softwarepakete stehen zur Verfügung, um jeden Schritt im Analyseprozess zu erleichtern.

5. Welche Herausforderungen sind mit der DNA-6mA-Sequenzierung verbunden?

Herausforderungen bei der 6mA-Sequenzierung von DNA umfassen die effiziente Anreicherung von 6mA-modifizierten DNA-Fragmenten, die genaue Erkennung von 6mA-Stellen unter anderen DNA-Modifikationen und die Interpretation von Sequenzierungsdaten, um die funktionale Bedeutung von 6mA-Modifikationen zu entschlüsseln. Darüber hinaus gibt es technische Variabilität und Bioinformatik Komplexitäten können Herausforderungen bei der Datenanalyse und -interpretation darstellen.

N⁶-methyladenin-DNA-Modifikation im menschlichen Genom

Journal: Molekulare Zelle

Impact-Faktor: 15,280

Veröffentlicht: 19. Juli 2018

Hintergründe

Der hier erwähnte Untersuchung verwendete die Präzision von PacBio SMRT-Sequenzierung Technologie, um die Überreste von 6mA im menschlichen Genom offenzulegen, mit besonderem Schwerpunkt auf der DNA der Mitochondrien.

Methoden

Ergebnisse

1. DNA 6mA-Modifikation tritt im menschlichen Genom auf

Die Studie nutzte PacBio-Sequenzierungsdaten, um über 880.000 6mA-Modifikationsstellen im menschlichen Genom zu identifizieren, mit einer Dichte von etwa 0,051 % der gesamten Adenine. Diese Dichte wurde bei Menschen als niedriger im Vergleich zu bestimmten anderen Organismen wie Pilzen, Chlamydomonas und C. elegans festgestellt, jedoch ähnlich wie bei Drosophila und Schweinen. Weitere Validierungen mittels 6mA-Immunpräzipitations-Sequenzierung (6mA-IP-seq) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) bestätigten das Vorhandensein von 6mA in menschlicher genomischer DNA.

Die Verteilung von 6mA-Stellen im menschlichen Genom variierte, wobei eine höhere Dichte in der mitochondrialen DNA im Vergleich zu den autosomalen Chromosomen beobachtet wurde. Die Chromosomen X und Y wiesen eine niedrigere 6mA-Dichte auf, im Gegensatz zu den höheren Ebenen von DNA-5mC-Modifikationen. Die Studie identifizierte auch Unterschiede in den 6mA-Modifikationsniveaus in verschiedenen chromosomalen Regionen, wobei eine Anreicherung in der Kategorie mit mittlerem Modifikationsniveau festgestellt wurde. Darüber hinaus wurden die chromosomalen Verteilungen von 6mA-haltigen DNA-Fragmenten, die mit verschiedenen Techniken identifiziert wurden, als konsistent befunden.

Abbildung 1. Verteilung der 6mA-Stellen im menschlichen Genom.

2. 6mA ist signifikant in Exon-Regionen angereichert.

Diese faszinierende Forschung untersuchte die Verteilung von 6mA-Modifikationen in funktionalen Zonen des menschlichen Genoms und stellte fest, dass die Mehrheit dieser Stellen in intronischen und intergenen Regionen lag. Eine erhebliche Anreicherung von 6mA wurde in exon-codierenden Bereichen festgestellt, was auf eine potenzielle Rolle bei der Modulation der Genexpression hindeutet. Diese Anreicherung blieb robust und konsistent, als sie mit verschiedenen Sequenzierungstechniken analysiert wurde, was ihre Unabhängigkeit von der Variabilität der Empfindlichkeitsniveaus der Methoden demonstriert. Im Gegensatz zu den Ergebnissen in anderen Modellorganismen wie C. reinhardtii gab es jedoch keine erkennbare Anreicherung von 6mA um Transkriptionsinitiations- und -terminierungsstellen, was weitere Untersuchungen in diesem Bereich anregt.

3. N6AMT1 ist eine Methyltransferase für 6mA im menschlichen Genom

Die Studie hatte zum Ziel, die Methyltransferase zu identifizieren, die für die DNA-6mA-Modifikation beim Menschen verantwortlich ist. Die N6-adeninspezifische DNA-Methyltransferase 1 (N6AMT1) wurde aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu bakteriellen 6mA-DNA-Methyltransferasen und ihrer potenziellen Rolle als S-Adenosyl-l-Methionin (AdoMet)-abhängige Methyltransferase identifiziert. Das Ausschalten von N6AMT1 führte zu einem Rückgang der DNA-6mA-Modifikationsniveaus, während die Überexpression diese Niveaus sowohl in vivo als auch in vitro erhöhte. Rekombinante N6AMT1-Flag erhöhten effizient die 6mA-Modifikationsniveaus in synthetischen Oligonukleotid-Substraten in vitro, ein Effekt, der durch eine Mutation des katalytisch konservierten Motivs NPPY aufgehoben wurde. Darüber hinaus führte der Knockout von N6AMT1 zu reduzierten genomischen DNA-6mA-Niveaus, die durch die ektopische Expression von Wildtyp-N6AMT1, jedoch nicht von einem Mutanten ohne das NPPY-Motiv, wiederhergestellt wurden. Diese Ergebnisse belegen zusammenfassend, dass N6AMT1 die Methyltransferase ist, die für die DNA-6mA-Modifikation im menschlichen Genom verantwortlich ist.

Abbildung 2. N6AMT1 ist eine Methyltransferase für die 6mA-Methylierung von DNA beim Menschen, und NPPY ist das katalytische Motiv von N6AMT1.

4. Abnahme der 6mA-Spiegel von genomischer DNA fördert die Tumorigenese

Die wissenschaftliche Untersuchung beschäftigte sich mit den Auswirkungen der DNA-6mA-Modifikation auf die Tumorentstehung durch die Modulation der Expression von N6AMT1 und ALKBH1 in malignen Zellen. Eine interessante Folge der Suppression von N6AMT1, die zu verringerten Konzentrationen von zellulärem genomischem DNA-6mA führte, war die Förderung tumoriger Eigenschaften wie Zellproliferation, Kolonieentstehung, Migration und Invasion; während eine hochregulierte N6AMT1 diese Prozesse entgegenwirkte. Im Gegensatz dazu hemmte die Suppression von ALKBH1, die zu einer Erhöhung der zellulären genomischen DNA-6mA-Konzentrationen führte, diese tumorigen Eigenschaften, die sich bei einer Überexpression von ALKBH1 wieder umkehrten. In-vivo-Validierungen stimmten mit diesen Beobachtungen überein, was sich in einer beschleunigten Tumorprogression in Xenografts mit N6AMT1-suppresierten Zellen und einem gegenteiligen Tumorprogressionstrend in solchen mit ALKBH1-suppresierten Zellen zeigte. Metastatische Knoten, die in den Lungen von Mäusen auftraten, spiegelten die Expressionslandschaften von N6AMT1 und ALKBH1 wider. Die Prognose des krebsbedingten Mortalitätsrisikos, gemessen durch die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse, war bei Mäusen mit N6AMT1-suppresierten Xenografts erhöht, während sie bei solchen mit ALKBH1-suppresierten Xenografts abnahm. Ergebnisse aus Rettungsassays mit Wildtyp- und Mutantenvarianten von N6AMT1 und ALKBH1 bestätigten diese Beobachtungen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf eine aufschlussreiche Hypothese hin, wonach eine verringerte genomische DNA-6mA-Modifikation in menschlichen Krebszellen das Potenzial hat, die Tumorigenese zu verstärken.

Abbildung 3. Abnahme des genomischen 6mA-Modifikationsniveaus fördert die Tumorigenese

Abbildung 4. Erhöhung des genomischen 6mA-Modifikationsniveaus hemmt die Tumorentstehung

Fazit

Die betreffende wissenschaftliche Untersuchung strebte an, das Vorkommen und die Relevanz von DNA N6-Methyladenin (6mA)-Modifikationen in menschlichen Zellen zu erkennen, die zuvor hauptsächlich als ein Phänomen betrachtet wurden, das charakteristisch für Prokaryoten ist. Durch die Entdeckung von über 880.000 6mA-Stellen im menschlichen Genom und die umfassende Bewertung ihrer Verteilung und funktionalen Implikationen gelang es der Forschung, die Rolle von 6mA in der Genregulation zu enthüllen. Besonders hervorzuheben ist, dass die Enzyme N6AMT1 und ALKBH1 als wesentliche Akteure bei der Verwaltung der Dynamik von 6mA-Modifikationen identifiziert wurden. Von entscheidender Bedeutung war die Erkenntnis, dass Schwankungen der 6mA-Spiegel eng mit der Entstehung von Krebs verbunden waren, was den potenziellen Wert von 6mA als Biomarker und möglichen therapeutischen Hebel bei der Behandlung von Krebserkrankungen nahelegte.

Referenz:

1. Xiao C L, Zhu S, He M, et al. N6-Methyladenin-DNA-Modifikation im menschlichen Genom. Molekulare Zelle, 2018, 71(2): 306-318. e7.