Bisulfid-Genomsequenzierung (BSP-Seq) - Methylierungsidentifikation für ssDNA und dsDNA

Einer der wichtigsten Mechanismen der epigenetischen Modifikation ist DNA-MethylierungEs hat einen erheblichen Einfluss auf die Genexpression, der direkt die zelluläre Aktivität beeinflusst. Es handelt sich um ein epigenetisches Ereignis, das die genomische Prägung, die embryonale Entwicklung, die zelluläre Differenzierung, die X-Inaktivierung und die Zellproliferation moduliert. Abnormale DNA-Methylierung wird jedoch häufig mit DNA- und genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, was zur Entwicklung von Krankheiten wie Krebs führen kann. Wenn DNA-Methylierung an bestimmten wichtigen krebsbezogenen Genen auftritt, kann dies zur Stummschaltung von Tumorsuppressorgenen und zur Tumorentstehung führen. Dies schafft eine entscheidende Nachfrage nach hochsensiblen und zuverlässigen Methoden zur Erforschung innovativer diagnostischer und therapeutischer Strategien. Die Beleuchtung der Regionen der DNA-Methylierung erleichtert die Untersuchung der Zellentwicklung, der transkriptionalen Stummschaltung und der Entdeckung von Biomarkern.

Bisulfit-genomische Sequenzierung verwendet Natriumbisulfid zur DNA-Konversion, was die Analyse der DNA-Methylierung revolutioniert. Die Behandlung mit Bisulfid ist jedoch ein harscher Prozess, der eine stabile doppelsträngige DNA in fragmentierte Einzelstränge umwandelt, wobei die meisten Cytosine in Uracil umgewandelt werden. Diese Umwandlungen werfen Bedenken und Anpassungen bei der UV-Spektrophotometrie, PCR und Agarose-Gelelektrophorese auf.

Abbildung 1. Bisulfit-Konversion und Sequenzierung von Proben (Li, 2011)

Die Methylierung auf einem DNA-Strang kann erkannt werden, wenn unmethylierte Cytosine in einzelsträngiger DNA in Uracil-Reste umgewandelt werden, die in der anschließenden PCR-Amplifikation als Thymin erkannt werden. Auf der anderen Seite sind methylierte Cytosine immun gegen diese Umwandlung und bleiben als Cytosine erhalten, was es ermöglicht, methylierte Cs von unmethylisierten zu unterscheiden. Die Bestimmung des Methylierungsstatus an den interessierenden Loci erfordert eine anschließende PCR-Reaktion unter Verwendung spezifischer Methylierungsprimer nach der Behandlung mit Natriumbisulfid. Der Methylierungsstatus kann entweder durch direkte Sequenzierung des PCR-Produkts oder durch Subklon-Sequenzierung ermittelt werden. Allerdings liefert die direkte Sequenzierung des PCR-Produkts in der Regel eine schlechte Qualität und kann die Quantifizierung verfälschen; daher wird Klonierung gefolgt von Sequenzierung empfohlen. Darüber hinaus kann die Pyrosequenzierung als Alternative zur direkten PCR-Sequenzierung verwendet werden.

Die Bisulfit-Sequenzierungsanalyse kann nicht nur die Methylierung entlang des DNA-Einzelstrangs identifizieren, sondern auch die Muster der Methylierung auf DNA-Doppelsträngen erkennen, da die Amplifikationsprodukte einzeln gemessen werden können und die umgewandelten DNA-Stränge nicht mehr selbstkomplementär sind. Abbildung 1 zeigt die Highlights des DNA-Umwandlungsprozesses. Ein UV-Spektrophotometer wird zur Quantifizierung der umgewandelten DNA als RNA verwendet. Zur Beurteilung der Qualität wird die umgewandelte DNA auf einem 2%igen Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Die Banden erscheinen als Schlieren von 1500 bis 100 bp. Die Bisulfit-PCR-Primer sind länger, während die Amplicons kürzer sind als normal. Die Whole-Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) und die Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) sind die beiden Ansätze, die verwendet werden können, um die DNA-Methylierung mithilfe von NGS zu bewerten.

Referenz:

1. Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA-Methylierungsnachweis: Bisulfid-genomische Sequenzierungsanalyse. Methoden in der Molekularbiologie, 2011, 791, 11–21.