NGS-BSP

CD Genomics ist auf NGS-BSP-Dienste spezialisiert und bietet fortschrittliche Möglichkeiten für umfassende DNA-MethylierungsanalyseUnser Service nutzt modernste Technologie. NGS-Technologie um methylierten Cytosinen genau zu kartieren und zu quantifizieren, wodurch detaillierte Einblicke in epigenetische Modifikationen über verschiedene biologische Proben hinweg ermöglicht werden. Dies ermöglicht eine präzise Charakterisierung der Mechanismen der Genregulation und erleichtert die Forschung zu komplexen Krankheiten.

Die Einführung von NGS-BSP

DNA-Methylierung beeinflusst stark die Chromatinstruktur und die Regulation der Genexpression. Seit vielen Jahren dient die Bisulfit-Sequenzierung-PCR (BSP) als der "Goldstandard" zur Messung der DNA-Methylierung spezifischer Regionen. BSP weist eine hohe Zuverlässigkeit und Genauigkeit auf und kann den Methylierungsstatus jeder CpG-Stelle im Fragment genau bestimmen. Die Nächste Generation Sequenzierung-basierte Bisulfid-Sequenzierung PCR (NGS-BSP) kann genauere Informationen über Methylierungsmodifikationen finden und ist anwendbar auf einige Gene, die bekannte methylierte Nachweisregionen sind, und eignet sich auch zur Erforschung signifikanter Methylierungsregionen von Genen.

Experimentelles Prinzip von BSP:

Genomisches DNA wird mit Bisulfit behandelt, wodurch alle unmethylierten Cytosine in Uracil umgewandelt werden, während methyliertes Cytosin unverändert bleibt. Anschließend werden Primer an beiden Enden der CpG-Inseln für die PCR-Amplifikation entworfen. Die gereinigten Zielprodukte werden dann mithilfe der TA-Klonierung kloniert. Jeder Klon wird dann zur Sequenzierung ausgewählt, um positive Klone zu identifizieren. Schließlich werden die erhaltenen Sequenzen mit der ursprünglichen Sequenz verglichen, um die Methylierungsstellen zu bestimmen und den Grad der Methylierung zu quantifizieren.

Abbildung 1. Experimentelles Prinzip von BSP.

Vorteile unseres NGS-BSP-Services

• Schnelle Erkennung aller Methylierungsstellen
• Hohe Durchsatzrate, hohe Genauigkeit, einfache und intuitive Ergebnisse
• Kosteneffektiver und zeitsparender als das ursprüngliche BSP, wenn viele Proben getestet werden.

Anwendungen von NGS-BSP

• Epigenetikforschung
• Klinische Anwendungen
• Umwelt- und Exposom-Studien
• Agrar- und Viehforschung

NGS-BSP Arbeitsablauf

Kurz gesagt, BSP-Primer wurden mit der Online-Software MethPrimer entworfen. Genom-DNA (1 µg) wurde mit dem ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO) umgewandelt, und ein Zwanzigstel der Elutionsprodukte wurde als Vorlage für die PCR-Amplifikation verwendet. Für jede Probe wurden BSP-Produkte mehrerer Gene erzeugt, gleichmäßig zusammengeführt und einer Adaptorligierung unterzogen. Barcodierte Bibliotheken aus allen Proben wurden auf der Illumina Hiseq-Plattform mit der paired-end 150 bp Strategie sequenziert.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen gDNA-Menge: ≥ 1 μg; DNA-Konzentration ≥ 30 ng/μl, OD260/280=1,8~2,0 Alle DNA-Proben sollten mit RNase behandelt werden und keine Zersetzung oder Kontamination aufweisen. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren individuellen Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Illumina HiSeq, PE150. Deckungstiefe ≥ 100x.
	Bioinformatische Analyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Verarbeitung von Rohdaten Ausrichtung von Sequenzierungsdaten Bewertung der Bisulfit-Umwandlungsrate in Sequenzierungsdaten Analyse der Sequenzierungstiefe und Abdeckung in Zielregionen Berechnung der Methylierungslevels von Cytosin (C) Visualisierung der Methylierungslevels in Zielregionen Statistische Analyse der Verteilung des Methylierungsniveaus in Zielregionen Clusteranalyse der Methylierungsniveaus in Zielregionen über mehrere Proben hinweg Angepasste Analyse Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in NGS-BSP für Ihr Schreiben (Anpassung)

CD Genomics bietet Ihnen in jeder Phase des Prozesses eine Beratung an, um sicherzustellen, dass Sie Ihre Daten optimal nutzen. Wir bieten professionelle Unterstützung von der Planung der Experimente über das Sequenzieren bis hin zur weiteren Datenanalyse. Wenn Sie Anforderungen haben, lassen Sie es uns bitte wissen, und wir werden Ihnen gerne helfen. Wir würden uns freuen, die Gelegenheit zu haben, mit Ihnen zusammenzuarbeiten. Bitte kontaktieren Sie uns für weitere Informationen und ein detailliertes Angebot.

Referenzen

1. Pan X, Gong D, Nguyen DN, u. a.Frühe mikrobielle Besiedelung beeinflusst die DNA-Methylierung von Genen, die mit der intestinalen Immunität und dem Stoffwechsel bei frühgeborenen Schweinen in Verbindung stehen. DNA-Forschung, 2018.
2. Zhang S, Shen L, Xia Y, u. a.DNA-Methylierungslandschaft von Fettablagerungen und Fettsäurezusammensetzung bei fettleibigen und schlanken Schweinen. Wissenschaftliche Berichte, 2016, 6:35063.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Wie wird der Bisulfitbehandlungsprozess durchgeführt?

Die Bisulfitbehandlung beinhaltet die Exposition von DNA gegenüber Natriumbisulfit, was zur Deaminierung von unmethylierter Cytosin-Reste zu Uracil führt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Diese chemische Modifikation ermöglicht die Unterscheidung zwischen methylierter und unmethylierter Cytosine während der Sequenzierung und erleichtert die anschließende Analyse von DNA-Methylierungsmustern.

2. Welche gängigen Werkzeuge werden für die Analyse von NGS-BSP-Daten verwendet?

Verschiedene spezialisierte Werkzeuge und Software werden für die Analyse von NGS-BSP-Daten verwendet, einschließlich:

• FastQC: zur Bewertung der Qualität von Rohsequenzierungsdaten.
• Trim Galore: zum Entfernen von niedrigqualitativen Reads und Adaptersequenzen.
• Bismark: zum Ausrichten von bisulfit-behandelten Reads auf das Referenzgenom und zur Bestimmung der DNA-Methylierungslevels.
• SAMtools: zur Verwaltung von Alignierungsdateien.
• MethylKit: zur Durchführung von differentieller Methylierungsanalyse und zur Visualisierung der Ergebnisse.
• IGV (Integrative Genomics Viewer): zur Visualisierung von Methylierungsmustern.
• HOMER: zur Annotierung funktioneller genomischer Elemente.
• KEGG- und GO-Analyse: zur Aufklärung biologischer Wege, die durch Veränderungen der DNA-Methylierung beeinflusst werden.

3. Was sind die wichtigsten Überlegungen bei der DNA-Extraktion in NGS-BSP?

Für die erfolgreiche Umsetzung von NGS-Die Gewinnung von hochwertiger DNA ist ein Grundpfeiler. Es ist wichtig, die folgenden Überlegungen zu berücksichtigen:

Einsatz von DNA-Extraktionstechniken, die DNA mit hoher Reinheit und Integrität liefern. Verhinderung von Kontaminationen mit RNA, Proteinen oder anderen fremden Verunreinigungen. Sicherstellung, dass die DNA in ausreichender Menge und Konzentration für nachfolgende Anwendungen vorhanden ist.

4. Wie wird die Effizienz der Bisulfit-Konversion bewertet?

Die Wirksamkeit der Bisulfit-Konversion kann auf verschiedene Weise bewertet werden:

• Einbeziehung von unmethyliertem Kontroll-DNA und Sicherstellung einer vollständigen Umwandlung (Fehlen von verbleibenden Cytosinen).
• Sequenzierung von bisulfid-konvertierter DNA und Bestimmung der Umwandlungsrate (Prozentsatz der unmethylierten Cytosine, die in Uracil umgewandelt wurden).
• Einsatz von Spike-in-Kontrollen oder internen Standards zur Überwachung der Effizienz der Umwandlung.

5. Wie entwirft man Primer für NGS-BSP?

Entwicklung von Primern für NGS-BSP erfordert besondere Aufmerksamkeit aufgrund der durch die Bisulfitbehandlung induzierten Sequenzmodifikationen:

• Entwicklung von Primern ohne Cytosine, um ihre Umwandlung in Uracile zu ermöglichen (die nach der PCR in Thymin umgewandelt werden).
• Nutzung von Software-Tools wie MethPrimer oder BiSearch zur Erstellung von bisulfitspezifischen Primern.
• Überprüfung der Primer-Effizienz und -Spezifität durch Validierung mit bisulfitbehandelter DNA.

Änderungen der Promotermethylierung in der Plazenta, die an der Beziehung zwischen pränataler Depression und klein für das Gestationsalter beteiligt sind.

Zeitschrift: BMC Schwangerschaft und Geburt

Impactfaktor: 3,105

Veröffentlicht: 02. Oktober 2022

Hintergrund

Depression und Angstzustände während der Schwangerschaft betreffen 10% bis 40% der schwangeren Frauen und stehen im Zusammenhang mit niedrigem Geburtsgewicht und SGA. Erhöhte Glukokortikoidspiegel aufgrund einer Dysfunktion der HPA-Achse können die fetale Entwicklung über die Plazenta beeinflussen, die die Glukokortikoidexposition über HSD11β2 reguliert. Schilddrüsenhormone (HPT-Achse) und Melatonin (HPA-Achse) spielen ebenfalls eine Rolle. Materielle Emotionen können epigenetische Veränderungen der Plazenta verursachen. Diese Studie wird nutzen Next-Generation-Sequenzierung und DNA-Methylierungsanalyse Techniken zur Untersuchung der Beziehung zwischen SGA und mütterlichen Emotionen, insbesondere zur Untersuchung von Methylierungsänderungen in Genen wie CRH, HSD11β2, SLC16A10, DIO3 und MTNR1B.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Eine geschachtelte Fall-Kontroll-Studie fand heraus, dass mütterliche Depressionen im zweiten Trimester ein Risikofaktor für SGA sind. Die Plazenten wurden basierend auf dem Depressions- und SGA-Status in vier Gruppen unterteilt, mit jeweils 17 Proben. Die Methylierungslevels der CRH- und DIO3-Gene waren bei depressiven Müttern höher, während die HSD11β2-Levels bei nicht-depressiven Müttern höher waren. Die Methylierung von CRH und HSD11β2 korrelierte mit Depressionen, und die DIO3-Methylierung korrelierte mit SGA, was darauf hindeutet, dass mütterliche Depressionen die fetale Entwicklung durch diese epigenetischen Veränderungen beeinflussen könnten.

Abbildung 1. Methylierung der Gene CRH, HSD11β2, SLC16A10, DIO3 und MTNR1B in der Plazenta.

Abbildung 2. Vergleich der Methylierungslevels von Plazentagenen (CRH, HSD11β2, DIO3, SLC16A10 und MTNR1B) in vier Gruppen.

Abbildung 3. Vergleich des Methylierungsniveaus von CRH, HSD11β2, DIO3, SLC16A10, MTNR1B in Abhängigkeit von der Depression der Mutter und der SGA-Geburt.

Fazit

Maternale Depression im zweiten Trimester stört die HPA- und HPT-Achsen und erhöht das Risiko für SGA durch Veränderungen der Plazentagenmethylierung (DIO3, HSD11β2, CRH). Frühes Screening und Interventionen sind entscheidend aufgrund potenzieller langfristiger Auswirkungen auf das Verhalten und die Entwicklung des Nachwuchses. Gesundheitsfachkräfte sollten emotionalen Support für schwangere Frauen priorisieren und die Nachkommen depressiver Mütter auf Entwicklungsbeeinträchtigungen überwachen. Eine Erhöhung der Stichprobengrößen in zukünftigen Forschungen wird die Validität dieser Ergebnisse verbessern.

Referenz

1. Yang J, Xu A, Zhang Y, et al. Veränderungen der Promotermethylierung in der Plazenta, die mit der Beziehung zwischen pränataler Depression und kleinen Geburtsgewicht für das Gestationsalter verbunden sind. BMC Schwangerschaft und Geburt2022, 22(1):741.