Transkriptom-Sequenzierung von Virusinfektionen Protokoll

Infektion von Zellen

1. CRFK-Zellen in 75 cm einbringen² Kolben und bei 37 °C mit 5 % CO inkubieren₂ bis die Zellen eine Konfluenz von 60–70 % erreichen.
2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit D-PBS.
3. Infizieren Sie die Flaschen mit dem Virus bei einer Infektionsmultiplikation (MOI) von 2 in 2 ml oder 2 ml D-PBS als Mock-Kontrolle und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO.₂ Für 1 Stunde zur Anheftung. Führen Sie Inokulationen in Duplikaten durch, eine für die RNA-Extraktion und die andere zur Visualisierung der zytopathischen Effekte (CPE).
Fügen Sie 10 ml Erhaltungsmedium mit 10 % FBS hinzu und inkubieren Sie die Flaschen für 3 Stunden.
5. Nach 3 Stunden Inkubation das Inokulum entfernen und die Zellen mit D-PBS waschen.
6. Fügen Sie 2 ml TrypLE hinzu und inkubieren Sie für 1–2 Minuten, bis sich die Zellen ablösen.
7. Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und pelleted Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 120 × g für 5 Minuten und entsorgen Sie das Überstand.
8. Fügen Sie 10 ml D-PBS hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation, um jede Spur von Medium und TrypLE zu entfernen, die den RNA-Ertrag verringern könnte.
9. Entsorgen Sie die Überstände und lagern Sie die Zellpellets bei −80 °C bis zur RNA-Reinigung.

RNA-Reinigung aus infizierten Zellen

Das RNeasy-Kit wurde in dieser Studie verwendet, um RNA-Proben zu extrahieren und zu reinigen, aber auch andere RNA-Extraktionsprotokolle könnten geeignet sein.
1. Sprühen Sie alle Mikropipetten, Handschuhe, den Arbeitsbereich und andere Gegenstände mit RNase AWAY, um RNase- und DNA-Kontaminationen zu entfernen.
2. Extrahieren Sie RNA mit dem RNeasy-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Aliquotieren Sie die eluierte RNA (500 μl) in drei verschiedene Röhrchen, um ein wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Probe zu vermeiden, was die Qualität der RNA beeinträchtigen könnte.
4. Verwenden Sie zwei Röhrchen für die Qualitätskontrollanalyse mit einem Spektrophotometer und dem Illumina Agilent 2100 Bio-Analyzer und lagern Sie das dritte bei −80 °C für die Sequenzierung.

Analyse der Gesamt-RNA-Qualität

1. Bestimmen Sie die Qualität der extrahierten RNA, indem Sie die Absorption bei 260 und 280 nm in einem UV/Visible-Spektrophotometer messen.
2. Berücksichtigen Sie die Proben mit dem Absorptionsverhältnis (A260/A280) von 1,8 bis 2,0 für eine weitere Analyse mit dem Illumina Agilent 2100 Bioanalyzer, um sowohl die RNA-Qualität als auch die RNA-Quantität zu bestimmen.
3. Um sicherzustellen, dass die Proben von höchster Qualität und Quantität für die Transkriptom-Sequenzierung sind, führen Sie eine Qualitäts- und Quantitätsanalyse der extrahierten Gesamt-RNA-Proben durch.
4. Laden und vorbereiten Sie die Gel-Farbstoff-Mischungen, und laden Sie dann Marker, Leiter und Proben in der angegebenen Weise.
5. Vortexen Sie den Chip und setzen Sie ihn ein. Analysieren Sie die Chips gemäß der vom Hersteller empfohlenen Methode. Überprüfen Sie, ob der Lauf erfolgreich ist und ob die Probe ordnungsgemäß vorbereitet und gehandhabt wurde, indem sie korrekt in die Wells pipettiert wurde.

Probenvorbereitung für Paired-End-Sequenzierung

Führen Sie die folgenden Schritte mit den in dem Kit zur Vorbereitung von Paar-End-Proben enthaltenen Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
1. Fragmentieren Sie genomische DNA in Fragmente von weniger als 800 bp.
2. Führen Sie die Endreparatur von DNA-Fragmenten durch, um 5'-phosphorylierte stumpfe Enden zu erzeugen.
3. Fügen Sie an die 3'-Enden eine "A"-Base hinzu, um einen 3'-dA Überhang zu erzeugen.
4. Ligieren Sie Adapter an die Enden der DNA-Fragmente.
5. Reinigen Sie die Ligationserzeugnisse, indem Sie nicht ligierte Adapter entfernen.
6. Bereichern Sie die adapter-modifizierten DNA-Fragmente durch PCR.
7. Erhalten Sie die genomische DNA-Bibliothek.