ITS- und Fungal-Amplicon-Sequenzierung: Untersuchung von Pilzgemeinschaften in Boden, Pflanzenwurzeln und klinischen Proben

Ein Feldökologe, der Mykorrhiza-Wurzeln in einem gemäßigten Wald sammelt, ein Pflanzenpathologe, der verfolgt Fusarium Welchen Bereich der pilzlichen ribosomalen DNA sollte ich sequenzieren, und welche Primer erfassen die Gemeinschaft, die mich tatsächlich interessiert? Die Antwort ist selten einfach – sie hängt davon ab, ob Ihre Pilze in Pflanzenwurzeln, freilebend im Boden oder die menschliche Schleimhaut besiedeln.

Dieser Artikel ist ein praktischer Leitfaden zur Sequenzierung von internen transkribierten Spacer (ITS) Ampliconen zur Analyse von Pilzgemeinschaften. Wir erläutern die Entscheidungen, die bestimmen, ob ein ITS-Projekt eine auflösbare taxonomische Einordnung auf Art-Ebene liefert, welche Extraktions- und Primerstrategien für jede Probenmatrix geeignet sind und wie man die häufigsten Fallstricke vermeidet, die Daten zu Pilzgemeinschaften in uninterpretierbare Listen von nicht klassifizierten OTUs verwandeln. Für Forscher, die die Analyse von Pilzgemeinschaften auslagern, 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung CD Genomics deckt den gesamten ITS-Workflow von der Proben-QC bis zur taxonomischen Klassifikation ab.

Warum Fungi mit ITS studieren?

Das Pilzreich wird auf 2,2 bis 3,8 Millionen Arten geschätzt, von denen weniger als 10 % formal beschrieben wurden. Sie sind zentral für den Kohlenstoffkreislauf an Land, die Nährstoffaufnahme von Pflanzen und — zunehmend anerkannt — die menschliche Gesundheit und Krankheit. Die Identifizierung von Pilzen anhand von Morphologie oder Kultur ist jedoch langsam, verzerrt zugunsten sporulierender Taxa und blind für nicht kultivierbare Arten. Die DNA-basierte Identifizierung löst dieses Problem, und der interne transkribierte Spacer (ITS) des ribosomalen RNA-Operons ist der Konsens-Barcode.

Der ITS-Bereich liegt zwischen den rRNA-Genen 18S (kleine Untereinheit) und 28S (große Untereinheit). Er wird transkribiert, aber während der rRNA-Reifung herausgeschnitten, was bedeutet, dass er Mutationen schneller ansammelt als die angrenzenden kodierenden Regionen – schnell genug, um Arten zu unterscheiden, aber innerhalb der Arten ausreichend konserviert, um als zuverlässiger Barcode zu dienen. Der ITS-Bereich ist in ITS1 (zwischen 18S und 5,8S) und ITS2 (zwischen 5,8S und 28S) unterteilt, getrennt durch das hochkonservierte 5,8S-Gen.

Welche Subregion schneidet besser ab? Die Antwort hängt von der Pilzgruppe ab. ITS1 bietet eine höhere Auflösung für Basidiomycota – das Phylum, das Rostpilze, Brandpilze und die meisten pilzbildenden Fungi umfasst. ITS2 übertrifft ITS1 für Ascomycota, das größte Pilzphylum, das die meisten Schimmelpilze, Pflanzenpathogene und klinisch relevante Hefen umfasst. Für Studien, die beide Phyla gleichermaßen anvisieren, bietet die vollständige ITS-Region (ITS1 + 5.8S + ITS2, ungefähr 450-700 bp je nach Art) die höchste taxonomische Abdeckung. Das weit verbreitete Primerpaar ITS1F/ITS4 amplifiziert die vollständige ITS-Region und bleibt die gängigste Wahl für die allgemeine Profilierung von Pilzgemeinschaften.

Die UNITE-Datenbank ist die zentrale Referenz für die Taxonomie von Pilzen. Im Gegensatz zu SILVA oder Greengenes2, die alle drei Lebensbereiche abdecken, wird UNITE speziell für Pilze kuratiert und verwendet ein dynamisches Spezieshypothesen (SH) Clusterungssystem mit Identitätsgrenzen von 97-99 %. Für die meisten Pilz-ITS-Projekte bietet die Klassifizierung gegen UNITE v9.0+ mit einer Clusterungsschwelle von 97 % Artenzuweisungen für gut untersuchte Gruppen und Gattungszuweisungen für untercharakterisierte Umweltlinien.

Kritisch ist es, zu wissen, was ITS nicht kann. ITS unterscheidet zuverlässig keine Stämme innerhalb einer Art, erfasst keinen funktionalen Geninhalt und funktioniert nicht für nicht-fungale Eukaryoten. Wenn Ihre Frage eine Verfolgung auf Stamm-Ebene erfordert — das Nachverfolgen eines Fusarium oxysporum forma specialis über verschiedene Bereiche hinweg oder das Verfolgen eines Candida auris Ausbruch in einem Krankenhaus – ITS allein ist unzureichend. Es sagt Ihnen, welche Arten vorhanden sind und ihre relativen Häufigkeiten, nicht welche Metaboliten sie produzieren oder ob sie Gene für antifungale Resistenzen tragen.

Abbildung 1: Struktur der ITS-Region im Pilz-rDNA-Operon — ITS1 vs. ITS2 Abdeckung und taxonomische Auflösung

ITS-Sequenzierungs-Workflow

DNA-Extraktion: Das Problem der Pilzzellwand

Pilzzellwände sind robuster als bakterielle Zellwände – Chitin- und Glucan-Polymere widerstehen den enzymatischen Lyseprotokollen, die gut für gramnegative Bakterien funktionieren. Sporen sind noch widerstandsfähiger. Das Bead-Beating mit 0,5 mm Zirkonia/Silicabeads in einem Hochgeschwindigkeits-Homogenisator (FastPrep oder Precellys) ist das Minimum, um DNA aus Sporen und melaninisierten Hyphen zu gewinnen. In einem direkten Vergleich von Extraktionsmethoden für Bodenpilzgemeinschaften ergaben Protokolle, die mechanische Lyse (Bead-Beating) verwendeten, 40-60% mehr pilzliche OTUs als ausschließlich enzymatische Protokolle, und der Unterschied war am ausgeprägtesten für Ascomycota – das Phylum, das die meisten Pflanzenpathogene umfasst.

Für Pflanzenwurzelsamples funktioniert die Co-Extraktionsherausforderung in beide Richtungen. Pflanzen-DNA kann den Extrakt dominieren (Wurzelgewebe besteht zu >95 % aus Pflanzenmasse), was das Pilzsignal in der nachfolgenden Sequenzierung verdünnt. Eine Oberflächensterilisation mit 2 % Natriumhypochlorit, gefolgt von sterilen Wasser-Spülungen, entfernt oberflächenhaftende Pilzsporen, bewahrt jedoch endophytische und mykorrhizale Pilze im Inneren der Wurzel. Für Rhizosphärenboden ist der Standardansatz, die Wurzeln kräftig in steriler PBS zu schütteln, die Bodenschlämme zu sammeln und aus dem Pellet zu extrahieren – dies bereichert die an den Wurzeln haftende Pilzgemeinschaft, ohne die Probe mit Pflanzen-DNA zu überwältigen.

Für klinische Proben — Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit, Hautabstriche, Vaginalabstriche — ist menschliche DNA der dominante Kontaminant. Im Gegensatz zu 16S, wo Wirts-DNA fehlt (Säugetiere haben keine 16S-Gene), amplifizieren ITS-Primer keine menschliche DNA, da Menschen das pilzliche rDNA-Operon nicht besitzen. Das bedeutet, dass kein Wirts-Depletionsschritt für die pilzliche ITS-PCR aus menschlichen klinischen Proben erforderlich ist — ein deutlicher praktischer Vorteil gegenüber bakteriellen 16S, wo Wirts-DNA mit dem mikrobiellen Template in Proben mit niedrigem Biomassegehalt konkurrieren kann.

PCR-Primer: Die Verzerrung, die Sie nicht vermeiden können

Jedes ITS-Primerpaar hat taxonomische blinde Flecken. Das weit verbreitete ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) in Kombination mit ITS2 (GCTGCGTTCTTCATCGATGC) amplifiziert nur ITS1. Dieses Paar erfasst die meisten Ascomycota und Basidiomycota, unter-amplifiziert jedoch früh divergierende Pilzlinien (Chytridiomycota, Mucoromycota), zu denen auch arbuskuläre Mykorrhizapilze in den Glomeromycota gehören – arguably die ökologisch bedeutendste Pilzgruppe für die Pflanzenbiologie.

Für Studien, die sich auf arbuskuläre Mykorrhizapilze (AMF) konzentrieren, sind die speziellen Primerpaare AML1/AML2, die die 18S-Region anvisieren, oder spezifische AMF-ITS-Primer (z. B. NS31/AML2) den allgemeinen Pilz-ITS-Primern überlegen. AMF-spezifische Primer erfassen Glomeromycota, die von allgemeinen ITS-Primern vollständig übersehen werden. Der Nachteil: AMF-spezifische Primer sind blind für nicht-AMF-Pilze, daher benötigen Sie eine Zwei-Amplikon-Strategie (allgemeine ITS + AMF-spezifisch) für eine umfassende Profilierung der Pilzgemeinschaften in den Wurzeln.

Für die ITS2-Region zielt das Primerpaar ITS3/ITS4 (oder das modifizierte ITS3N/ITS4N) auf einen Bereich von ~250-350 bp ab und hat den Vorteil einer geringeren Längenvariation zwischen den Pilzlinien im Vergleich zu ITS1, was die bioinformatische Verarbeitung vereinfacht und die PCR-Längenverzerrung reduziert. Die auf ITS2 basierende Klassifizierung unter Verwendung der UNITE-Datenbank erreicht Artenzuweisungen für 80-90% der in Böden und pflanzenassoziierten Umgebungen häufig vorkommenden Pilzgattungen.

PCR-Bedingungen sind wichtig. Die Amplifikation von Fungal ITS erfolgt typischerweise mit 25-35 Zyklen. Über 30 Zyklen steigt das Risiko der Chimärenbildung erheblich. Die Annealing-Temperatur ist entscheidend: 52-55°C bietet das beste Gleichgewicht zwischen Ertrag und Spezifität für ITS1F/ITS4; höhere Annealing-Temperaturen verringern den Ertrag unterrepräsentierter Taxa. Fügen Sie immer eine No-Template-Kontrolle und mindestens eine positive Kontrolle (eine simulierte Pilzgemeinschaft mit bekannter Zusammensetzung) in jede PCR-Platte ein.

Bioinformatik: Die UNITE-QIIME 2 Pipeline

Die bioinformatische Analyse von Fungal ITS unterscheidet sich in zwei wichtigen Punkten von 16S. Erstens sind ITS-Amplicons längenvariabel: ITS1 einer Pilzart kann 200 bp lang sein, während ITS1 einer anderen 400 bp lang ist. Das bedeutet, dass Standard-Algorithmen für das paired-end Merging, die von einer einheitlichen Ampliconlänge ausgehen, angepasst werden müssen. Der ITS-spezifische Workflow von DADA2 bewältigt dies, indem er Primersequenzen trimmt, basierend auf Qualitätswerten filtert und dann Denoising und Merging mit entspannten Längenbeschränkungen durchführt.

Zweitens verwendet die Taxonomiezuweisung gegen UNITE einen kuratierten, pilzspezifischen Klassifikator. Der mit QIIME 2 kompatible UNITE-Klassifikator (verfügbar als vortrainierte .qza-Dateien von der UNITE-Website) weist die Taxonomie unter Verwendung des dynamischen Spezies-Hypothese (SH) Systems zu. Für die meisten Projekte bietet der auf 97% OTUs trainierte "UNITE dynamische" Klassifikator die beste Balance zwischen Auflösung und Genauigkeit. Die Ausgabe umfasst SH-Identifikatoren (z. B. SH1234567.08FU), die Ihre Sequenzen mit dem UNITE-Referenzsystem verknüpfen und einen direkten Vergleich zwischen Studien ermöglichen.

ASV-Resolution – die Erzeugung von Amplicon-Sequenzvarianten anstelle von OTU-Clustern – funktioniert für Fungal-ITS-Daten, erfordert jedoch Vorsicht. Der ITS-Bereich enthält intragenomische Varianten innerhalb eines einzelnen Pilzgenoms (mehrere rDNA-Kopien mit leicht unterschiedlichen ITS-Sequenzen; beide haploiden Kerne in dikaryotischen Pilzen können unterschiedliche ITS-Allel tragen), und DADA2 kann diese in separate ASVs aufteilen. Das Post-Clustering von ASVs mit 97% Identität stellt die artenlevelige Auflösung wieder her, die Pilzökologen erwarten, ohne die aufgeblähte Vielfalt der rohen ASV-Zählungen.

Abbildung 2: End-to-End ITS Amplicon-Sequenzierungs-Workflow — Von der Probenentnahme bis zum taxonomischen Profil

Boden- und Wurzelassoziierte Pilzgemeinschaften

Mykorrhizale Netzwerke: Die unterirdische Wirtschaft

Arbuskuläre Mykorrhizapilze (AMF, Phylum Glomeromycota) bilden Symbiosen mit etwa 80 % der terrestrischen Pflanzenarten. Sie erweitern das Wurzelsystem der Pflanzen um ein Vielfaches und tauschen Bodenphosphor und -stickstoff gegen pflanzliche Fotosynthesewirkstoffe. Ektomykorrhizapilze (ECM, hauptsächlich Basidiomycota und Ascomycota) assoziieren sich mit den meisten temperierten und borealen Baumarten. Beide Gruppen sind ökologisch zentral und methodisch herausfordernd zu untersuchen — AMF, weil sie nicht von allgemeinen ITS-Primer erfasst werden, und ECM, weil das Pilzgewebe mit Wurzelzellen vermischt ist.

Für AMF-fokussierte Studien ist die Strategie einfach: Verwenden Sie AMF-spezifische 18S-Primer (AML1/AML2 oder NS31/AML2) für die Mykorrhiza-Komponente und allgemeine ITS für die breitere Pilzgemeinschaft. Für ECM-Studien funktionieren allgemeine ITS-Primer gut bei ectomykorrhizalen Wurzeltipps, die einzeln präpariert und zusammengeführt wurden, aber Bulk-Wurzelproben werden von saprotrophen und endophytischen Pilzen dominiert.

Bodenpilzgemeinschaften zeigen eine extreme räumliche Heterogenität im Zentimetermaßstab. Ein einzelnes Gramm Waldboden kann DNA von über 1.000 Pilzarten enthalten, die Saprotrophe, Pathogene und Mutualisten umfassen. Für Studien zu Bodenpilzgemeinschaften ist eine Mischprobe unerlässlich: Entnehmen Sie 5-10 Kerne aus jedem Plot, homogenisieren Sie diese und extrahieren Sie aus einer repräsentativen Teilprobe. Für Rhizosphärenboden speziell entnehmen Sie den Boden, der nach sanftem Schütteln an den Wurzeln haften bleibt; dies ist das Rhizosphärenkompartiment, das sich von dem mehrere Meter entfernten Boden unterscheidet.

Agrarische Boden Gesundheit und Biokontrolle

Bodenpilzgemeinschaften werden zunehmend als Indikatoren für die Gesundheit landwirtschaftlicher Böden verwendet. Saprotrophe Pilze – die Ernterückstände zersetzen und Nährstoffe recyceln – nehmen tendenziell unter Minimalbodenbearbeitung und Zwischenfruchtanbau zu. Pathogene Pilze neigen dazu, unter kontinuierlicher Monokultur zuzunehmen. Das Verhältnis von saprotrophen zu pathotrophen funktionalen Gilden, abgeleitet aus ITS-Daten unter Verwendung von FUNGuild oder FungalTraits, bietet einen quantitativen Index für die Bodenqualität, der chemische Messungen ergänzt.

Trichoderma Arten gehören zu den am häufigsten untersuchten Biokontrollpilzen. Sie parasitieren Pilzpathogene, produzieren antimikrobielle Sekundärmetaboliten und induzieren die systemische Resistenz von Pflanzen. Die ITS-Sequenzierung von Bulkboden- oder Rhizosphärproben erkennt Trichoderma auf der Gattungsebene, aber eine Auflösung auf Art-Ebene erfordert Vollständige 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung oder zusätzliche Marker (tef1, rpb2) da die ITS1-Region allein nicht die Trichoderma harzianum Artenkomplex. Für die Isolat-Ebene Identifikation, Mikrobielle Identifizierung Dienste integrieren ITS mit ergänzenden genetischen Markern.

Endophyten: Die Pilzgemeinschaft in Blättern und Stängeln

Blattendophyten — Pilze, die asymptomatisch in den Blättern und Stängeln von Pflanzen leben — gehören zu den vielfältigsten und am wenigsten verstandenen Komponenten des Pflanzenmikrobioms. Sie beeinflussen die Trockenheitstoleranz, die Widerstandsfähigkeit gegen Herbivoren und die Anfälligkeit für Pathogene. Die ITS-Amplicon-Sequenzierung war das primäre Werkzeug zur Katalogisierung der Diversität von Endophyten, da die meisten endophytischen Pilze nicht auf Standardmedien kultiviert werden können.

Die größte Herausforderung bei der ITS-Profilierung von Endophyten ist die Oberflächen-Dekontamination. Die Blattoberflächen beherbergen zahlreiche epiphytische Pilze (Hefen, Schimmelsporen), die sich von der inneren Endophyten-Gemeinschaft unterscheiden. Die Oberflächensterilisation mit 2% Natriumhypochlorit (30-60 Sekunden), 70% Ethanol (2 Minuten) und drei Spülungen mit sterilem Wasser ist Standard, aber die Behandlungszeit muss je nach Pflanzenart kalibriert werden – zu kurz und Epiphyten bleiben bestehen, zu lang und das Sterilisationsmittel dringt in das Blatt ein und tötet die Endophyten. Die einfachste Validierung: Platten Sie das letzte Spülwasser auf PDA-Agar aus und überprüfen Sie nach 5 Tagen auf das Wachstum von Pilzen.

Pflanzenpathogenüberwachung mit ITS

Pilzpathogene verursachen schätzungsweise 10-23 % Ernteverluste weltweit, und der Klimawandel erweitert das geografische Verbreitungsgebiet vieler Arten. Die ITS-Amplicon-Sequenzierung bietet zwei Vorteile für die Überwachung von Pathogenen im Vergleich zu traditionellen Methoden: Sie erkennt Pathogene, bevor Symptome auftreten, und erfasst den gesamten Kontext der Pilzgemeinschaft, in dem ein Pathogen agiert.

Schlüsselpathogene, die durch ITS nachweisbar sind

Fusarium Arten (Ascomycota: Hypocreales) verursachen Welkekrankheiten, Wurzelfäule und Kopfvergilbungen bei Getreide-, Gemüse- und Zierpflanzen. ITS klärt die Fusarium Genus sauber, aber die Unterscheidung auf Art-Ebene innerhalb der F. oxysporum und F. solani Artenkomplexe erfordern den Übersetzungs-Elongationsfaktor 1-alpha (tef1) Gen. Für Umfragen, bei denen es wichtig ist, "Fusarium ist bei X% relativer Häufigkeit vorhanden" ausreichend, ITS funktioniert gut. Für Studien, die erfordern, welche Fusarium Arten treiben Krankheiten voran, paaren Sie ITS mit einem Fusariumspezifischer protein-codierender Marker.

Verticillium dahliae und V. albo-atrum Ursache für Welkekrankheiten bei über 200 Pflanzenarten. ITS unterscheidet zuverlässig zwischen den beiden Arten, was die ITS-Profilierung von Boden zu einem praktischen Risikoabschätzungstool vor der Pflanzung macht. Eine Bodenprobe mit >1% Verticillium Die relative Häufigkeit von ITS sagt stark die Welkentwicklung in anfälligen Pflanzen voraus, die in der folgenden Saison gepflanzt werden.

Puccinia (Rostpilze, Basidiomycota) und andere obligate Biotrophe können nicht auf künstlichen Medien kultiviert werden – die ITS-Sequenzierung direkt aus infiziertem Blattgewebe ist die praktischste Identifikationsmethode. Die Rostpilze haben ungewöhnlich große ITS-Regionen (ITS1 kann 500 bp überschreiten), sodass Primerpaare, die nur ITS2 anvisieren (ITS3/ITS4), eine konsistentere Amplifikation über Rostarten hinweg erzeugen als vollständige ITS-Primerpaare.

Krankheitsunterdrückende Böden

Einige landwirtschaftliche Böden unterdrücken von Natur aus pilzliche Krankheitserreger – ein Phänomen, das von antagonistischen Mitgliedern des Bodenmikrobioms angetrieben wird. Die ITS-Sequenzierung von suppressiven im Vergleich zu förderlichen Böden hat eine konsistente Anreicherung spezifischer pilzlicher Gattungen identifiziert.Chaetomium, Clonostachysund spezifisch Trichoderma Kladengruppen) in suppressiven Böden. Für Landwirte und Agronomen kann das ITS-Profiling von Feldböden Felder mit natürlich suppressiven Pilzgemeinschaften identifizieren, die möglicherweise weniger Fungizide benötigen — eine Anwendung der Präzisionslandwirtschaft, die von der Forschung in die kommerzielle Praxis übergeht.

Abbildung 3: Boden- und Wurzelpilzgemeinschaften — Mykorrhizale Netzwerke und Pathogeninteraktionen

Das menschliche Mycobiom in Gesundheit und Krankheit

Der menschliche Körper beherbergt Pilzgemeinschaften (das Mycobiom) an jeder mukosalen Oberfläche — Mundhöhle, Atemwege, Magen-Darm-Trakt, Vaginaltrakt und Haut. Das Mycobiom hat eine deutlich geringere Biomasse als das Bakteriom (Pilze machen <0,1 % der gesamten mikrobiellen Gene im Stuhl aus), und diese geringe Häufigkeit schafft einzigartige technische Herausforderungen für die ITS-basierte Profilierung.

Gut Mycobiom

Im gesunden menschlichen Darm, Candida, Saccharomycesund Malassezia Die dominierenden Pilzgattungen werden durch ITS-Sequenzierung nachgewiesen, jedoch ist die interindividuelle Variation deutlich höher als bei Darmbakterien – das Pilzprofil eines Menschen im Darm ähnelt eher einem Fingerabdruck als einem konservierten Gemeinschaftstyp. Längsschnittstudien zeigen, dass sich die Pilzgemeinschaften im Darm dynamischer verändern als die bakteriellen Gemeinschaften über Tage bis Wochen, was wahrscheinlich den diätetischen Pilzaufnahmen (Käserinden, Brot, fermentierte Lebensmittel) und dem vorübergehenden Durchgang von Umweltpilzen entspricht.

Für Studien zum Mykobiom des Darms sind Stuhl-DNA-Extraktionsprotokolle, die für Bakterien optimiert sind (z. B. DNeasy PowerSoil Pro), in der Lage, Pilz-DNA angemessen zu extrahieren. Allerdings bedeutet das niedrige Verhältnis von Pilz- zu Bakterien-DNA, dass die Amplifikation von Pilz-ITS-Regionen eine höhere Anzahl von PCR-Zyklen (35-40 Zyklen) erfordert, um einen ausreichenden Bibliotheksausstoß zu erzeugen. Die Folge sind erhöhte Chimärenbildung und PCR-Abdrift – biologische Replikate und negative Kontrollen sind für Pilz-ITS wichtiger als für bakterielle 16S aus derselben Stuhlprobe.

Atemwegs-Mikrobiom

Der untere Atemweg wurde lange Zeit als steril angesehen, aber die ITS-Sequenzierung von bronchoalveolärem Lavage (BAL)-Flüssigkeit hat eine Pilzgemeinschaft mit niedriger Biomasse offenbart, die von Umweltpilzen dominiert wird.Cladosporium, Penicillium, Aspergillus) bei gesunden Personen. Bei Patienten mit Mukoviszidose, Asthma oder COPD verschiebt sich das respiratorische Mykobiom — Aspergillus fumigatus und Candida albicans sind die häufigsten pilzlichen Besiedler, und ihre Anwesenheit ist mit einem beschleunigten Rückgang der Lungenfunktion bei CF verbunden.

Die dominierende technische Herausforderung bei Studien zum respiratorischen Mykobiom besteht darin, Kontaminationen der Atemwege und Reagenzien zu kontrollieren. Die Pilzbiomasse in BAL-Flüssigkeit liegt im Bereich von Pikogramm, was Extraktionsleerröhrchen und PCR-Kontrollen ohne Vorlage unverzichtbar macht. In einer gut kontrollierten Studie erscheinen Pilztaxa, die in negativen Kontrollen auftreten (typischerweise Cladosporium, Alternariaund Penicillium — häufige luftgetragene Pilze) müssen von der Analyse abgezogen oder ausgeschlossen werden. Ohne diesen Schritt ist das berichtete respiratorische Mykobiom überwiegend ein Katalog von Laborluft- und Kitverunreinigungen.

Oraler und Haut-Mikrobiom

Die orale ITS-Profilierung identifiziert konsistent Candida als das dominante Pilzgenus in der Mundhöhle, aber Malassezia, Aspergillusund Fusarium erscheinen ebenfalls in geringerer Häufigkeit. Der orale Hefeträger erhöht sich mit der Verwendung von Zahnprothesen, Xerostomie (trockener Mund) und Immunsuppression. Mundspülungen oder Zungenabstriche eignen sich gut für die ITS-Profilierung – es sind keine speziellen Entnahmeeinrichtungen erforderlich, und die hohe Pilzlast in oralen Proben bedeutet, dass 25-30 PCR-Zyklen ausreichend sind.

Malassezia dominiert das Hautmycobiom, insbesondere im Gesicht, auf der Kopfhaut und im oberen Rumpf – Regionen, die reich an Talgdrüsen sind. Malassezia Arten sind lipidabhängig, und ihre Häufigkeit korreliert mit der Talgproduktion. ITS1 ist ausreichend für Malassezia Artenidentifikation auf Artenebene für die häufigen Arten (M. restricta, M. globosa, M. sympodialis), aber seltenere Arten in der Gattung profitieren von ITS2-Sequenzierung oder vollständigem ITS.

Abbildung 4: Humanes Mycobiom – Wichtige Körperstellen und dominante Pilz-Taxa durch ITS-Profiling

Wählen Sie Ihre ITS-Strategie

ITS1 vs. ITS2: Abschließende Empfehlung

Wählen Sie ITS1 (Primerpaar ITS1F/ITS2), wenn Ihre Studie auf Basidiomycota (Rostpilze, Brandpilze, ECM-Pilze, Holzzerstörende Pilze) abzielt, wenn Sie maximale Kompatibilität mit der größten Anzahl veröffentlichter ITS-Datensätze benötigen oder wenn Ihre Proben aus Boden oder Pflanzen stammen, wo die Diversität der Basidiomycota hoch ist.

Wählen Sie ITS2 (Primerpaar ITS3/ITS4 oder ITS3N/ITS4N), wenn Ihre Studie auf Ascomycota (Schimmelpilze, Pflanzenpathogene, Hefen) abzielt, wenn Sie mit dem menschlichen Mykobiom arbeiten, in dem die meisten klinisch relevanten Pilze Ascomycota sind, oder wenn Sie die geringere Variation der Amplifikationslängen schätzen, die die bioinformatische Verarbeitung vereinfacht.

Wählen Sie das vollständige ITS (ITS1F/ITS4), wenn Sie maximale taxonomische Breite über alle Pilzphyla benötigen und Ihre Sequenzierungsplattform Amplicons von bis zu 700 bp unterstützt (MiSeq v3 2×300 bp mit Überlappung; PacBio; Nanopore).

Abbildung 5: ITS1 vs ITS2 Entscheidungsrahmen — Die richtige Amplicon-Strategie wählen

Sequenzierungstiefe und biologische Replikate

Pilz-ITS-Bibliotheken aus den meisten Probenarten erreichen die Sättigung bei 50.000-100.000 Reads pro Probe – ähnlich wie bei bakteriellen 16S. Bodenproben, die die vielfältigsten Pilzgemeinschaften enthalten, benötigen möglicherweise 100.000-150.000 Reads für die Sättigung der Rarefaktionskurve.

Die Anforderungen an biologische Replikate spiegeln die für 16S wider: 5-8 pro Gruppe für Studien zu Pflanzen in kontrollierten Umgebungen (mit Topf oder Parzelle als experimentelle Einheit), 20-30 pro Gruppe für humanmedizinische Querschnittsstudien zum Mycobiom und 8-12 pro Behandlung für landwirtschaftliche Studien im Feldmaßstab. Technische Replikate liefern im Allgemeinen nur vernachlässigbare Informationen für ITS, wie auch für 16S.

Kostenfaktoren und Budgetplanung

Die Kosten pro Probe für die ITS-Amplicon-Sequenzierung sind erheblich gesunken, aber die Gesamtkosten gehen über die Sequenzierung selbst hinaus. Bei der Budgetierung für ein ITS-Projekt sind die Hauptkostenkomponenten die DNA-Extraktion (höher für Boden- und Pflanzenproben, die zusätzliche Reinigung erfordern), die PCR-Amplifikation und die Bibliotheksvorbereitung (ein Amplicon für nur ITS, zwei Amplicons für duales ITS + 16S), die Sequierungstiefe (50K-150K Reads pro Probe, abhängig vom Proben-Typ) und die bioinformatische Analyse (standardisierte UNITE-taxonomische Klassifikation vs. benutzerdefinierte funktionale Vorhersagen). Als grobe Orientierung für die Budgetierung von Stipendien: Ein ITS-Projekt mit 50 Proben, das eine standardisierte DNA-Extraktion aus Bodenproben und grundlegende bioinformatische Analysen umfasst, liegt typischerweise im Bereich von 50-100 USD pro Probe bei den meisten CROs, während ein duales ITS + 16S-Projekt 30-50% zu den Kosten pro Probe hinzufügt.

Hinweis: Die genauen Preise hängen von der Probenart, der DNA-Qualität und der Analyseebene ab. Fordern Sie immer ein umfassendes Angebot an, das die Extraktion bis zur Bioinformatik abdeckt, und bestätigen Sie, dass die Proben über die Sequenzierungsplatten hinweg randomisiert sind, um Batch-Effekte zu vermeiden.

Integration von ITS mit 16S und anderen Ansätzen

Eine wachsende Anzahl von Studien sequenziert sowohl ITS als auch 16S aus denselben Proben – Pilz- und Bakteriengemeinschaftsprofile aus demselben DNA-Extrakt, amplifiziert mit separaten Primer-Sets. Dieser Dual-Marker-Ansatz erfasst die gesamte mikrobielle Gemeinschaft und zeigt Pilz-Bakterien-Interaktionen, die mit keinem der Marker allein nachgewiesen werden können. Bei der Planung einer dualen ITS + 16S-Studie sollten Sie genügend DNA extrahieren, um sie in zwei Aliquots für die separate PCR-Amplifikation zu teilen, anstatt zu versuchen, beide Primer-Sets in einer einzigen Reaktion zu multiplexen.

Ein duales ITS + 16S-Projekt mit 50 Proben kostet typischerweise 30-50 % mehr als ein Einzelmarker-Projekt derselben Größe – die zusätzlichen Kosten resultieren aus der zweiten PCR-Amplifikation, der zweiten Bibliotheksvorbereitung und der zusätzlichen Sequierungstiefe, die erforderlich ist, um eine angemessene Abdeckung für beide Amplicons zu erreichen. Dennoch bleibt die kombinierte Kosten pro Probe für beide Marker weit unterhalb eines flachen Shotgun-Metagenoms (5M Reads pro Probe), was die Sequenzierung von Dualmarker-Amplicons zur wirtschaftlichsten Methode für umfassende Profiling von bakteriellen und pilzlichen Gemeinschaften macht. Bei der Anfrage von Angeboten bei einem CRO sollte bestätigt werden, dass beide Amplicons auf demselben Flusszellen sequenziert werden können, um die Kosteneffizienz zu maximieren, und es sollte klargestellt werden, ob die bioinformatische Analyse für beide Marker (UNITE für ITS, SILVA für 16S) im Standardanalysepaket enthalten ist oder separat berechnet wird.

Wenn Ihre Frage eine funktionale Annotation erfordert – was machen diese Pilze? – wird die ITS-Taxonomie allein keine Antwort darauf geben. Metagenomische Shotgun-Sequenzierung erfasst Pilzgenome zusammen mit Bakteriengenomen und bietet eine direkte funktionale Genannotierung, einschließlich Profile von carbohydrate-active enzymes (CAZy) und sekundären Metaboliten biosynthetischen Genclustern. Für Studien zur Pflanzen-Pilz-Interaktion, bei denen auch das Transkriptom des Wirts von Interesse ist, RNA-Seq erfasst sowohl die Genexpression von Pflanzen als auch die Genexpression von Pilzen aus infiziertem Gewebe gleichzeitig. Wenn Sie eine Artenauflösung benötigen, die über das hinausgeht, was der Standard-ITS bietet – um Artenkomplexe in Fusarium, Trichodermaoder Candida — Vollständige 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung Die Verwendung von PacBio- oder Nanopore-Plattformen schließt die Auflösungsdifferenz.

Für eine umfassendere Perspektive darauf, wie ITS in die Landschaft der Multi-Marker-Amplicon-Sequenzierung passt – einschließlich 16S für Bakterien, 18S für Protisten und DNA-Barcoding zur Artenidentifikation – siehe den Artikel. Amplicon-Sequenzierungsdienste für Mikrobiom- und Biodiversitätsforschung: 16S, 18S, ITS und DNA-Barcoding-LösungenFür die artenbezogene Identifizierung einzelner Pilisolate (statt der Gemeinschaftsprofilierung) bieten DNA-Barcoding-Dienste zur Artenidentifizierung: COI, rbcL, matK und darüber hinaus ergänzende Ansätze.

CD Genomics' Amplicon-Sequenzierungsdienste unterstützen sowohl Einzelmarker- (ITS oder 16S) als auch Dualmarker-Projekte mit standardisierten UNITE + SILVA-Bioinformatik-Pipelines und maßgeschneiderten Analyseoptionen für Studien zur Pilzgemeinschaft. Für Forscher, die absolute Pilzabundanz anstelle von relativen Anteilen benötigen, Absolute quantitative 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung fügt Spike-in-Standards hinzu, um die ITS-Lesezahlen in absolute Pilzzellzahlen pro Probe umzuwandeln.

Häufig gestellte Fragen

Q: Was ist besser für die Profilierung von Pilzgemeinschaften — ITS1 oder ITS2?

ITS1 bietet eine bessere Auflösung für Basidiomycota; ITS2 für Ascomycota. Für eine ausgewogene Abdeckung im gesamten Pilzreich ist das vollständige ITS (ITS1F/ITS4, ~450-700 bp) die beste Wahl. Wenn technische Einschränkungen die Länge des Amplicons begrenzen, bietet ITS2 (~250-350 bp) eine geringere Längenvariation und eine gleichmäßigere Amplifikation über die Pilzlinien hinweg.

F: Können allgemeine ITS-Primer arbuskuläre Mykorrhiza-Pilze (AMF) nachweisen?

Nein, nicht zuverlässig. Der weit verbreitete ITS1F-Primer weist Fehlanpassungen gegenüber Glomeromycota auf. Für AMF-fokussierte Studien sollten AMF-spezifische 18S-Primer (AML1/AML2 oder NS31/AML2) parallel zu allgemeinen ITS-Primern für die breitere Pilzgemeinschaft verwendet werden.

Q: Wie verhindere ich, dass Pflanzen-DNA meine ITS-Bibliotheken von Wurzelpilzen dominiert?

Oberflächensterilisieren Sie die Wurzeln mit 2% Natriumhypochlorit (30-60 Sekunden), spülen Sie sie mit steriler Wasser und extrahieren Sie DNA direkt aus dem Wurzelgewebe. ITS-Primer amplifizieren keine pflanzliche DNA (Pflanzen haben das Pilz-rDNA-Operon nicht), aber co-extrahierte Pflanzenverbindungen (Polyphenole, Polysaccharide) können die PCR hemmen. Eine Nachreinigung nach der Extraktion mit PVP oder SPRI-Perlen verbessert die Amplifikation aus pflanzlichen Extrakten.

Q: Welche negativen Kontrollen sind für die Sequenzierung von Fungal ITS unerlässlich?

Die gleichen drei Kontrollen wie für 16S: Extraktionsleerprobe (Kontrolle ohne Probe, die den gesamten Extraktionsworkflow durchläuft), PCR-Leerprobe (Wasser in molekularer Qualität anstelle von DNA-Vorlage) und Feldleerprobe (ein steriler Tupfer oder ein Probenahmegerät, das der Probenumgebung ausgesetzt ist). Fungal ITS-Projekte sind besonders empfindlich gegenüber kontaminierenden Sporen aus der Luft — Cladosporium, Penicilliumund Alternaria kommen häufig in negativen Kontrollen vor.

F: Wie viele Reads pro Probe benötige ich für ITS?

50.000-100.000 für die meisten Probenarten. Bodenproben am oberen Ende (100.000-150.000). Menschliche Mycobiom-Proben (Stuhl, Haut, oral) am unteren Ende (30.000-50.000) aufgrund geringerer Pilzvielfalt.

F: Kann ich denselben DNA-Extrakt für ITS- und 16S-Sequenzierung verwenden?

Ja. DNA, das mit Bead-Beating-Protokollen (z. B. DNeasy PowerSoil Pro) extrahiert wurde, erfasst sowohl bakterielle als auch pilzliche DNA. Teilen Sie den Extrakt in zwei Aliquots für die separate ITS- und 16S-PCR-Amplifikation auf. Multiplexen Sie nicht beide Primer-Sets in einer einzelnen PCR-Reaktion – die Primer werden sich gegenseitig stören.

Q: Wie zuverlässig ist ITS für die Artenidentifikation von klinischen Pilzen?

Zuverlässig für häufige klinische Pilze (Candida albicans, C. glabrata, Aspergillus fumigatus, A. niger, Cryptococcus neoformans) bei der Verwendung von UNITE als Referenzdatenbank. Für weniger häufige klinische Pilze oder innerhalb von Artenkomplexen (z. B. Candida parapsilosis komplex), ITS kann nur auf Gattung oder Artenkomplexebene aufgelöst werden.

Q: Welche Bioinformatik-Pipeline sollte ich für Fungal ITS-Daten verwenden?

DADA2 mit dem ITS-spezifischen Workflow (Primer trimmen, filtern, denoisen, zusammenführen mit lockeren Längenbeschränkungen), gefolgt von der Taxonomiezuweisung gegen den UNITE dynamischen Klassifikator (QIIME 2-kompatibles .qza-Format). Post-Cluster ASVs mit 97% Identität, um intragenomische Varianten in artenlevel Einheiten zu konsolidieren.

Referenzen:

1. Nilsson RH, Larsson KH, Taylor AFS, et al. Die UNITE-Datenbank zur molekularen Identifizierung von Pilzen: Umgang mit dunklen Taxa und parallelen taxonomischen Klassifikationen. Nukleinsäurenforschung2019;47(D1):D259-D264. doi:10.1093/nar/gky1022
2. Hoggard M, Vesty A, Wong G, et al. Charakterisierung der menschlichen Mykobiota: Ein Vergleich von kleinen ribosomalen RNA, ITS1, ITS2 und großen ribosomalen RNA genomischen Zielen. Grenzen der Mikrobiologie. 2018;9:2208. doi:10.3389/fmicb.2018.02208
3. Chen M, Dulya O, Mikryukov V, Copot O, Metsoja M, Tedersoo L. Probenentwurf und Probenverarbeitung beeinflussen die Bewertungen der Bodenbiodiversität. Molekulare Ökologie Ressourcen. 2026;e70113. doi:10.1111/1755-0998.70113
4. Bai D, Fang O, Li C, et al. Accu16S/AccuITS: Präzise und breit anwendbare Amplicon-Sequenzierung zur absoluten Quantifizierung von Mikrobiomen. iMeta2026;e70116. doi:10.1002/imt2.70116
5. Nash AK, Auchtung TA, Wong MC, et al. Das Darm-Mikrobiom der gesunden Kohorte des Human Microbiome Project. Mikrobiom2017;5(1):153. doi:10.1186/s40168-017-0373-4
6. Bittinger K, Charlson ES, Loy E, et al. Verbesserte Charakterisierung von medizinisch relevanten Pilzen im menschlichen Atemwegstrakt durch Next-Generation-Sequencing. Genomik Biologie2014;15:487. doi:10.1186/s13059-014-0487-y
7. Op De Beeck M, Lievens B, Busschaert P, et al. Vergleich und Validierung einiger ITS-Primerpaare, die für Studien zur Fungal-Metabarcoding nützlich sind. PLoS ONE2014;9(6):e97629. doi:10.1371/journal.pone.0097629
8. Smith DP, Peay KG. Sequenzentiefe, nicht PCR-Replikation, verbessert die ökologische Inferenz aus der DNA-Sequenzierung der nächsten Generation. PLoS ONE2014;9(2):e90234. doi:10.1371/journal.pone.0090234

Nur zu Forschungszwecken, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung gedacht.