Verbesserung der Vorhersage der Mikrobiomfunktion mit 16S-Vollsequenzierung

Die Verwendung von Next-Generation-Amplicon-Sequenzierungstechnologie hat innerhalb der Mikrobiomforschungs-Community Debatten ausgelöst, aufgrund ihrer inhärenten Einschränkungen, hauptsächlich ihrer kurzen Leselänge und der daraus resultierenden Knappheit an Informationen, die sie liefert. Die taxonomische Präzision von Marker-Genen ist ein entscheidender Faktor, der direkt die Zuverlässigkeit und Glaubwürdigkeit der Vorhersage von Mikrobiomfunktionen beeinflusst. Daher stellt sich eine zentrale Frage: Kann die Funktionsvorhersage basierend auf den Ergebnissen der Next-Generation-Amplicon-Sequenzierung als glaubwürdig angesehen werden, und gibt es eine überlegene Alternative, um effizientere und präzisere Forschung im Bereich der Funktionsvorhersage zu fördern?

Eine aktuelle Studie beschäftigte sich intensiv mit der Genauigkeit der Funktionsvorhersage und beleuchtete einige kritische Bedenken hinsichtlich der biologischen Fundiertheit der Vorhersage von Mikrobiomfunktionen. Diese Studie untersuchte die Rolle der taxonomischen Zusammensetzung, insbesondere wenn sie aus Kurzlesesequenzierungen abgeleitet wurde, und analysierte Faktoren wie die taxonomische Auflösung von Marker-Genen, die intragenomische Variabilität dieser Gene und die kompositionelle Natur von Mikrobiomdaten. Sie vertrat überzeugend die Auffassung, dass 16S Voll-Längen-Sequenzierung steht kurz davor, das Short-Read-Sequencing als primäre Methode zur Vorhersage der Mikrobiomfunktion abzulösen. Dieser Übergang wird voraussichtlich eine neue Ära einleiten, in der das 16S-Vollsequencing im Mittelpunkt der Vorhersage der Mikrobiomfunktion stehen wird und eine verbesserte Genauigkeit und Glaubwürdigkeit in diesem wichtigen Forschungsbereich bietet.

Vorhersage des funktionalen Potenzials aus taxonomischen Profilen des Mikrobioms, die durch Kurzlese-Amplicon-Sequenzierung erzeugt wurden. (Heidrich et al., 2022)

Taxonomische Auflösung in der 16S Voll-Längen-Sequenzierung

Im Bereich der Mikrobiologieforschung, Kurzlese-Amplicon-Sequenzierung Die Verwendung der Illumina-Plattform ist die vorherrschende Technologie der Wahl. Der PE300-Sequenzierungsmodus, der 2x300 Basenpaare lange Sequenzen erzeugt, wird weit verbreitet genutzt. In diesem Bereich wird hauptsächlich die Sequenzierung von kurzen Reads und langen Ampliconen verwendet, um die taxonomisch informativen Segmente der bakteriellen 16s ribosomalen RNA (rRNA) und der fungal internal transcribed spacer (ITS) Loci zu untersuchen. Allerdings zeigt die Sequenzierung von Teilregionen dieser Gene auf der Illumina-Plattform häufig Einschränkungen bei der Unterscheidung auf Artenebene und hat Schwierigkeiten, eng verwandte Stämme zu differenzieren.

Jüngste Fortschritte haben das Potenzial von Vollständige 16S-Sequenzierung, erreichbar durch Long-Read-Sequenzierungstechnologien wie PacBio, um die taxonomische Auflösung erheblich zu verbessern. Die vollständige 16S-Sequenzierung deckt umfassend alle neun Variablenregionen des 16S rRNA-Gens ab und liefert somit eine Fülle von Informationen, die die von Einzelregionensequenzierungen übertrifft. Sie verspricht eine präzise taxonomische Identifizierung auf Artenebene und kann effektiv Sequenzpolymorphismen erkennen, während sie taxonomische Positionen bestimmt.

Darüber hinaus, Vollständige 16S-Sequenzierung nicht nur Sequenzpolymorphismen genau identifiziert, sondern auch die Lokalisierung von Variationen auf Stammebene ermöglicht. Diese erhöhte Sensitivität fördert die Entdeckung neuer mikrobielle Arten und bietet eine treuere Darstellung der mikrobiellen Gemeinschaftsstrukturen innerhalb von Proben.

Während die Kosten für die vollständige 16S-Sequenzierung relativ hoch bleiben, wird erwartet, dass diese Technologie langfristig, unabhängig davon, ob sie erreicht wird durch Long-Read-Amplicon-Sequenzierung oder bioinformatische Rekonstruktion aus eindeutig identifizierten Kurzlese-Amplicon-Sequenzierungen wird allmählich die Kurzlese-Sequenzierungsmethoden ersetzen. Dieser Wandel verspricht, die taxonomische Auflösung zu erhöhen und folglich genauere Vorhersagen über mikrobielle Funktionen zu fördern.

Intragenomale Variabilität von Marker-Genen

Eine weitere Herausforderung bei der Analyse der Mikrobiomstruktur mithilfe von Amplicon-Sequenzierungsdaten liegt in den variierenden Kopienzahlen von Marker-Genen innerhalb mikrobieller Genome. Diese Variabilität wird gelegentlich fälschlicherweise als allelische Diversität interpretiert, was möglicherweise Verwirrung in die Analyse der Mikrobiomzusammensetzung einführt. Gleichzeitig erschwert die intragenomische Variabilität innerhalb der Marker-Gene die genaue Bewertung der relativen Bedeutung potenzieller Funktionen, was möglicherweise zu einer Überschätzung der Diversität innerhalb potenzieller Funktionsprofile führt.

Die Einschränkungen der Next-Generation-Sequencing (NGS)-Technologie werden offensichtlich durch ihre Unfähigkeit, intragenomische genetische Variabilität präzise zu identifizieren. Dies liegt hauptsächlich an der kurzen Leseweite der Technologie und der begrenzten Sequenzierungsabdeckung. Im krassen Gegensatz dazu, 16S Voll-Längen-Sequenzierung, gekennzeichnet durch ihre überlegene Abdeckung und Genauigkeit, zeichnet sich durch die präzise Identifizierung von Sequenzpolymorphismen und das Auffinden von Variationen auf Stamm-Ebene aus.

Die kompositionelle Natur von Mikrobiomdaten

Ein kritischer Aspekt, den man berücksichtigen sollte, ist, dass die Anzahl der Sequenzreads, die durch Next-Generation Sequencing (NGS) aus einer Probe erzeugt werden, nicht direkt mit der Anzahl der Bakterienzellen innerhalb dieser Probe korreliert, was es problematisch macht, Reads in bakterielle Häufigkeit zu übersetzen. NGS zeigt nur die relative Größe eines bestimmten Segments der mikrobiellen Gemeinschaft, das durch jede taxonomische Einheit repräsentiert wird. Dieses Merkmal stellt den NGS-Mikrobiom-Datensatz zusammen, um Einblicke in die relative Häufigkeit der Sequenzreads zu geben, ausgedrückt als Anteile oder Frequenzen von Taxa in einer mikrobiellen Gemeinschaft. Allerdings versagt es, Informationen über die absolute Häufigkeit von Taxa bereitzustellen, hauptsächlich weil die Gesamtgröße (mikrobielle Biomasse) der Gemeinschaft nicht offengelegt wird.

Folglich wird es, selbst wenn das vorhergesagte funktionale Profil einer Gemeinschaft mit ihrer tatsächlichen Funktion übereinstimmt, zu einer erheblichen Herausforderung, das Ausmaß des funktionalen Potenzials zu schätzen, da die Gesamtgröße der Bevölkerung der Gemeinschaft nicht berücksichtigt wird. Es gibt verschiedene Methoden zur quantitativen Bestimmung von Mikroben, um dieses Limit zu überwinden, aber sie können zusätzliche Datenheterogenität einführen.

Ein alternativer Ansatz zur Minderung des Problems bei der Analyse mikrobieller Kompositionsdaten ist die Verwendung von Verhältnissen. Diese Methode beseitigt Verzerrungen, die aus der Selbstbeladung von Mikroben resultieren, und hilft, Herausforderungen im Zusammenhang mit der PCR-Amplifikationsverzerrung zu überwinden, einer weithin anerkannten Fehlerquelle, die die Gemeinschaftszusammensetzung und funktionale Vorhersagen verzerren kann.

Die echte Funktion der Mikrobiota aufdecken

Ein weiterer, komplizierterer Ansatz besteht darin, die tatsächliche Funktion der Mikrobiota zu messen, wann immer dies möglich ist. Dieses Unterfangen ist jedoch nur unter bestimmten Bedingungen erreichbar: Die mikrobielle Gemeinschaft muss zugänglich sein, die Ziel-Funktion muss zum Zeitpunkt der Probenahme aktiv sein, und es sollte eine ausreichend große Populationsgröße und Probenvolumen für die Analyse zur Verfügung stehen. Für Mikrobiota, die diese Kriterien nicht erfüllen, dienen zusätzliche Techniken wie die Echtzeit-fluoreszenzquantitative PCR als wertvolle Ergänzungen zur quantitativen Charakterisierung des genetischen Potenzials bestimmter funktioneller Gene. Es ist wichtig zu erkennen, dass diese genetischen Potenziale nicht unbedingt mit tatsächlichen mikrobiellen Aktivitäten und Prozessen gleichzusetzen sind.

Aus dieser Perspektive erweisen sich histologische Techniken wie Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik als entscheidend, um das genetische Potenzial zu erforschen, das in Handlungen umgesetzt wurde. Die Kombination von funktionaler Vorhersage mit der Messung spezifischer Funktionen stellt einen wirkungsvollen Ansatz dar, um Einblicke in die mikrobielle Funktionalität zu gewinnen.

Referenz:

1. Heidrich, Vitor und Lukas Beule. "Sind Kurzlese-Amplicons geeignet zur Vorhersage des funktionalen Potenzials des Mikrobioms? Eine kritische Perspektive." iMeta 1.3 (2022): e38.