Metagenomsequenzierung vs. virale Amplicon-Sequenzierung: Auswahl effektiver Sequenzierungsmethoden zur Überwachung viraler Mutationen

Die Überwachung von viralen Mutationen hat aufgrund der Wahrscheinlichkeit von Mutationen während der viralen Übertragung an oberster Bedeutung gewonnen. Dies erfordert eine sorgfältige Verfolgung dieser Mutationen, was durch die Herausforderung, die Sensitivität der Virusdetektion zu erhöhen, zusätzlich erschwert wird. Der Kern der Herausforderung liegt darin, die gesamte virale Genomsequenz zu erhalten, um ein umfassendes Verständnis und die Überwachung von Mutationen zu ermöglichen. Gleichzeitig unterstreichen Überlegungen zur Kosten-Effektivität die Dringlichkeit für zahlreiche Einrichtungen, die sich mit Test- und Forschungsanstrengungen beschäftigen. In diesem Diskurs gehen wir auf eine umfassende Analyse von drei robusten Sequenzierungsmethoden ein—Metagenom-Sequenzierung, und Viral Amplicon-Sequenzierung—die Überprüfung ihrer Anwendungen, Vorteile und der komplexen Überlegungen, die mit der Überwachung viraler Mutationen verbunden sind.

Workflow von häufig verwendeten Methoden. (Liu et al., 2021)

Sequenzierungszweck: Schnelle Erkennung oder Sequenzzusammenstellung in der Virusüberwachung

Das Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie hat einen Paradigmenwechsel in unserer Fähigkeit herbeigeführt, neuartige Coronaviren und andere virale Pathogene zu erkennen und zu untersuchen. Die Entscheidung zwischen schneller Erkennung und sorgfältiger Sequenzzusammenstellung wird zu einem kritischen Punkt, der von den genauen Zielen der Untersuchung oder klinischen Anwendung abhängt und die sorgfältige Auswahl geeigneter Methoden und strategischer Ansätze erfordert.

Schnelle Erkennung: Eine rasche Reaktion auf aufkommende Bedrohungen

In zeitkritischen Szenarien, wie Krankheitsausbrüchen oder vermuteten Infektionen, hat die schnelle Identifizierung von viralen Krankheitserregern höchste Priorität. Das Arsenal der Hochdurchsatz-Sequenzierung spielt in solchen Kontexten eine entscheidende Rolle. Bei Herausforderungen wie der Bestätigung von Diagnosen bei Patienten mit negativen qPCR-Testergebnissen, der Unterscheidung komplexer oder sekundärer Infektionen oder der Durchführung umfassender Screenings eines großen Probenpools erweist sich die Hochdurchsatz-Sequenzierung als potente Lösung.

Vorteile:

• Zweckmäßigkeit: Hochdurchsatz-Sequenzierung beschleunigt die Identifizierung von viralen genetischen Materialien und ermöglicht schnelle Reaktionen auf potenzielle Ausbrüche.
• Umfassende Profilierung: Diese Technologie ermöglicht die gleichzeitige Erkennung mehrerer Virusarten innerhalb einer einzelnen Probe und erleichtert eine umfassende Bewertung der viralen Landschaft.
• Frühwarnsystem: Die schnelle Erkennung dient als Frühwarnmechanismus und ermöglicht es den Gesundheitsbehörden, rechtzeitige Interventionen und Eindämmungsmaßnahmen zu ergreifen.

Sequenzassemblierung: Entschlüsselung des genetischen Bauplans

Für eine tiefgehende und umfassende Analyse, insbesondere beim Umgang mit unbekannten Krankheitserregern oder beim Entschlüsseln der genetischen Zusammensetzung neu auftretender Viren, wird der Ansatz der Sequenzassemblierung durch Hochdurchsatz-Sequenzierung unverzichtbar. Diese Methodik umfasst den Erwerb vollständiger viraler Genomsequenzen, die es Forschern ermöglichen, in die komplexen Nuancen der viralen Evolution, Mutationen und potenziellen Virulenzfaktoren einzutauchen.

Vorteile:

• Genetische Aufklärung: Die Sequenzassemblierung bietet ein detailliertes Verständnis von viralen Genomen und unterstützt die Identifizierung wichtiger genomischer Segmente sowie potenzieller Ziele für Medikamente oder Impfstoffe.
• Evolutionsinsights: Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglicht es Forschern, die evolutionäre Entwicklung des Virus nachzuvollziehen, Mutationen zu enthüllen und potenzielle Anpassungsmuster zu entschlüsseln.
• Epidemiologische Erkenntnisse: Umfassende Genomsequenzen ermöglichen gründliche epidemiologische Studien, die es Forschern erlauben, die Ausbreitung und Evolution des Virus im Laufe der Zeit nachzuvollziehen.

Methodenauswahl

Die Wahl zwischen schneller Erkennung und Sequenzassemblierung erfordert eine vielschichtige Betrachtung verschiedener Parameter:

• Dringlichkeit: Die Dringlichkeit der Situation und das Gebot sofortiger diagnostischer Erkenntnisse.
• Ressourcen: Die Verfügbarkeit von Laborressourcen, einschließlich Ausrüstung, Personal und rechnerischen Fähigkeiten.
• Forschungsziele: Die spezifischen Ziele der Forschung, sei es epidemiologische Studien, die Entwicklung von Impfstoffen oder das Streben nach Erkenntnissen über die virale Evolution.
• Probenverfügbarkeit: Die Menge und Qualität der verfügbaren Proben für die Sequenzierung.

Sequenzierungsansätze: Metagenom-Sequenzierung vs. gezielte Sequenzierung 

Im Bereich der Hochdurchsatz-Sequenzierung zur Untersuchung viraler Genome treten zwei unterschiedliche Methoden als leistungsstarke Werkzeuge hervor: Metagenom-Sequenzierung und gezielte Sequenzierung. Jede Methode hat ihre eigenen Stärken, die ihre Eignung je nach spezifischen Anwendungen und Forschungszielen prägen.

Datenvolumen in der Sequenzierung: Anpassung der Menge an Methode und Zielsetzung

Die Menge der Sequenzierungsdaten hat eine entscheidende Bedeutung für den Erfolg der Analyse viraler Genome, die durch den beabsichtigten Sequenzierungszweck, die gewählte Methodik, die Viruslast und andere relevante Faktoren bestimmt wird. Ein Gleichgewicht zwischen Datenvolumen und spezifischen Anforderungen ist von entscheidender Bedeutung, um präzise Ergebnisse und aussagekräftige Erkenntnisse zu erzielen. Im Allgemeinen erhöht ein größeres Datenvolumen die Sensitivität, steigert die Positivitätsraten klinischer Tests und stärkt die Effektivität der viralen Sequenzassemblierung. Wichtige Überlegungen umfassen das Erreichen einer Abdeckung des viralen Genoms von über 95 % und einer Einzelbasen-Tiefe von mindestens 10x.

Metagenom-Sequenzierung: Anpassung des Datenvolumens an die Probenattribute

Für Metagenom-SequenzierungDas optimale Datenvolumen hängt von der Beschaffenheit des untersuchten Probenmaterials ab.

• Proben mit Viruslasten >10⁴ Kopien/ml oder qPCR CT-Werte <24,5:
• Empfohlene Datenmenge: 20 Gb (PE100, 100M Lesevorgänge)
• Begründung: Die Erhöhung des Datenvolumens in solchen Fällen verbessert die Sensitivität und erhöht die Wahrscheinlichkeit, positive klinische Testergebnisse zu erzielen.

Amplicon-Sequenzierung für Proben mit sehr niedriger Viruslast

Die Metagenom-Sequenzierung wird weniger effektiv, wenn sie mit Proben konfrontiert wird, die sehr niedrige Viruslasten aufweisen, insbesondere solchen mit CT-Werten über 28,7. In solchen Fällen ist ein alternativer Ansatz, wie die Multiplex-PCR-Amplicon-Sequenzierung, ratsam, um präzise und genaue Ergebnisse zu erzielen.

Multiplex-PCR-Amplikon-Sequenzierung: Präzision bei niedrigem Viruslast

Bei der Durchführung von Multiplex-PCR-Amplicon-Sequenzierung liegt das optimale Datenvolumen zwischen 5 und 20 Millionen Reads. Diese Technik erweist sich als besonders wertvoll, wenn Proben mit äußerst niedrigen Viruslasten untersucht werden, einschließlich solcher mit weniger als 10.² Kopien/ml.

Sequenzbibliotheksverarbeitung für die virale RNA-Sequenzierung

Im Bereich der viralen RNA-Sequenzierung stellt die Entscheidung, ob ribosomale RNA (rRNA) während der Bibliotheksvorbereitung eliminiert werden soll, eine entscheidende Überlegung dar, die die Qualität und den Erfolg des Sequenzierungsprozesses erheblich beeinflusst. Während rRNA einen signifikanten Anteil der Gesamt-RNA ausmacht (oft über 80 %), kann ihre Entfernung die Effizienz und Nützlichkeit der erzeugten Sequenzierungsdaten verbessern. Dennoch ist die Entscheidung, rRNA zu entfernen, komplex und hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Eigenschaften der Probe, des Eingabematerials und der Ziele der Bibliothekskonstruktion.

Die Bedeutung der rRNA-Entfernung

Ribosomale RNA spielt eine dominante Rolle in der zellulären RNA und fungiert als grundlegender Akteur bei der Proteinsynthese. Im Kontext der viralen RNA-Sequenzierung kann die Anwesenheit von rRNA den gewünschten Gehalt an viraler RNA verdünnen, was die Erkennung und treue Darstellung viraler Sequenzen beeinträchtigen kann. Durch selektive Entfernung von rRNA können Forscher die Sensitivität der viralen Detektion erhöhen, die Effizienz des Bibliotheksaufbaus verbessern und letztendlich die Relevanz der Sequenzierungsdaten für die virale Analyse steigern.

Musterüberlegungen

• Begrenzte Eingabe von viraler Nukleinsäure: In Szenarien mit knapper viraler Nukleinsäure, wie beispielsweise bei niedrigen Viruslasten, könnte die Entfernung von rRNA besonders vorteilhaft sein. Die Minimierung der rRNA-Interferenz ermöglicht eine gezielte Erfassung viraler Sequenzen, was potenziell präzisere und umfassendere Ergebnisse liefern kann.
• Degradierte Proben: Proben, die einer längeren Lagerung und erheblichen Degradation ausgesetzt sind, könnten nur geringe Mengen intakter viraler RNA enthalten. In solchen Fällen könnte die Entfernung von rRNA die Herausforderungen bei der Bibliotheksvorbereitung verschärfen, indem sie das verfügbare RNA-Material weiter verringert. In diesen Szenarien könnten Forscher von der Entfernung der rRNA absehen, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Bibliothekskonstruktion zu maximieren.

Ausgewogenheit zwischen rRNA-Entfernung und Bibliothekskonstruktion

Während die Entfernung von rRNA in zahlreichen Fällen Vorteile bietet, ist es entscheidend, ein Gleichgewicht zu erreichen, das mit den Zielen der Bibliothekskonstruktion und den Eigenschaften der Proben übereinstimmt. In bestimmten Szenarien könnte die Optimierung des Erfolgs der Bibliotheksvorbereitung die Entfernung von rRNA überwiegen, insbesondere wenn man es mit Proben konfrontiert ist, die durch eine geringe virale Abundanz oder erhebliche Zersetzung gekennzeichnet sind.

Zusammenfassung

• Für eine umfassende Analyse aller potenziellen pathogenen Mikroorganismen, einschließlich des Zielmikroorganismus, in Proben mit einer Viruslast von ≥10.⁵ copies/ml oder ein Ct-Wert ≤ 24,5 ist die empfohlene Vorgehensweise für die makro-genomische Sequenzierung.
• Bei der Fokussierung ausschließlich auf die Zielmikroorganismen und der Bearbeitung herausfordernder Proben (Viruslast <10⁵ copies/ml oder Ct >24,5), ist die Probenfang-Sequenzierung vorzuziehen, um geringfügige Basismutationen und Frequenzen zu erkennen, während für die Erfassung von größeren Basismutationen die Multiplex-PCR-Amplikon-Sequenzierung empfohlen wird.
• Für die gezielte Analyse des spezifischen Mikroorganismus, mit Schwerpunkt auf wichtigen Basismutationen, und der Arbeit mit schwierigen Proben (Viruslasten von bis zu 10).² Kopien/ml oder Ct-Werte von bis zu 35), ist die Multiplex-PCR-Amplicon-Sequenzierung die empfohlene Methode.

Referenz:

1. Liu, Yong-Xin, et al. "Ein praktischer Leitfaden zur Amplicon- und Metagenomanalyse von Mikrobiomdaten." Protein & Zelle 12,5 (2021): 315-330.