Was ist RNA-Sequenzierung (RNA-Seq)?

Im vergangenen Jahrzehnt hat sich die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) zu einem unverzichtbaren Werkzeug entwickelt, um die differentielle Genexpression im gesamten Transkriptom zu untersuchen und die differenzielle Spleißung von mRNA zu analysieren. Das Aufkommen der Sequenzierung der zweiten Generation (NGS) hat die weitverbreitete Anwendung von RNA-seq vorangetrieben und dessen Nutzen auf eine Vielzahl von RNA-zentrierten Untersuchungen ausgeweitet, einschließlich der Genexpression auf Einzelzellebene, RNA-Translation (Translatom) und RNA-Struktur. Spannenderweise werden neuartige Anwendungen wie räumliche Omik aktiv erforscht. Darüber hinaus leitet die Integration aufkommender Long-Read- und direkter RNA-seq-Technologien mit fortschrittlichen computergestützten Analysetools eine neue Ära des Verständnisses der RNA-Biologie ein. Dieser umfassende Ansatz ermöglicht es Forschern, komplexe Details zu entschlüsseln, die von der zeitlichen und räumlichen Transkription von Transkripten bis hin zu RNA-Faltungsdynamiken und molekularen Interaktionen reichen, die für die funktionale Erfüllung entscheidend sind.

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RNA-Seq ist eine anspruchsvolle Technik, die experimentelle Methoden mit computergestützten Werkzeugen kombiniert, um die Identität und Häufigkeit von RNA-Sequenzen in biologischen Proben zu entschlüsseln. Dies umfasst das Erkennen der Zusammensetzung von Adenin, Cytosin, Guanin und Uracil in einzelnen einzelsträngigen RNA-Molekülen, eine Leistung, die durch RNA-Sequenzierung erreicht wird. Experimentelle Verfahren in RNA-Seq umfasst die RNA-Extraktion aus Zellen, Geweben oder ganzen Organismen, die Erstellung vielfältiger RNA-Bibliotheken und die anschließende bioinformatische Datenanalyse.

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Wichtige Schritte in der RNA-Sequenzierung

Wichtige Schritte umfassen die Isolation von RNA aus verschiedenen Quellen, die Erstellung von unterschiedlichen RNA-Bibliotheken, die chemische Sequenzierung dieser Bibliotheken und die anschließende Analyse von Bioinformatikdaten. Eine bemerkenswerte Abweichung von früheren Techniken, wie Mikroarrays, liegt in der außergewöhnlichen Durchsatz- und Empfindlichkeit moderner Methoden. RNA-Seq Plattformen. Diese gesteigerte Fähigkeit ermöglicht es Forschern, neuartige Transkripte zu entdecken, Modelle der Genregulation zu erläutern und eine Vielzahl von nicht-kodierenden kleinen RNAs mit beispielloser Tiefe und Präzision zu erforschen.

Faktenblatt RNA-Sequenzierung und Datenanalyse ist ein hilfreicher Artikel, um die Schritte der Illumina-RNA-Sequenzierung zu verstehen.

Die Geschichte der RNA-Sequenzierungsplattformen

Die Entwicklung der RNA-Seq-Methoden ist eng mit den Fortschritten in der Sequenzierungstechnologie über Generationen hinweg verbunden. Zunächst begann die Hochdurchsatz-Sequenzierung mit den wegweisenden Sänger Doppelte Deoxy-Kettenabbruchtechnik. Dieses Verfahren erzeugte eine Reihe von Fragmenten, die sich um eine Base unterschieden, gefolgt von Kapillarelektrophorese zur Fragmenttrennung. Jeder Durchlauf, der 96 Kapillaren verwendete, lieferte kurze Sequenzen von 600 bis 1.000 Basen, insgesamt etwa 100.000 Basen an Sequenzdaten.

Die Ankunft von Next-Generation-Sequenzierung (NGS), revolutionierte das Feld durch die Anwendung der parallelisierten chemischen Synthese einzelner Nukleotide. Diese massive Parallelisierung ermöglichte es, dass einzelne Durchläufe Millionen von Sequenzierungsreaktionen umfassten. Zum Beispiel konnte in einem NGS-Durchlauf, der auf eine RNA-Sequenz von 100 Basen abzielte, eine erstaunliche Sequenzinformation von 6 gefolgt von 90 Nullen Basen erzeugt werden.

Langzeit-Sequenzierung baut auf diesen Innovationen auf und verwendet hauptsächlich großangelegte Sequenzierung während der Synthese durch chemische Synthese. Bemerkenswerterweise ermöglicht es die individuelle Sequenzierung jedes DNA- oder RNA-Moleküls, was die Länge der Sequenzlesungen erheblich erhöht, wobei einige bis zu 10.000 Nukleotide erreichen.

8 Schritte zur Auswahl der richtigen Plattform für RNA-Sequenzierung kann ein hilfreicher Artikel sein, der Ihnen bei der Auswahl der optimalen Plattform für Ihre Forschungsbedürfnisse im Bereich RNA-Sequenzierung hilft.

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Der Reichtum an Informationen, die gewonnen wurden aus RNA-Seq Daten sind umfangreich und transformativ. Sie ermöglichen die Identifizierung von Transkripten, die neue Proteine in embryonalen Stammzellen kodieren, und die Erkennung von überexprimierten Transkripten in Hautkrebszellen.

Diese Daten ermöglichen es Forschern, eine Vielzahl von Fragen zu stellen und zu beantworten: Welche Unterschiede bestehen in den Genexpressionsniveaus zwischen normalen und Krebszellen? Wie tragen Veränderungen in den Genexpressionsniveaus dazu bei, dass Krebszellen der Wirkung von Onkogenen entkommen? Welche Veränderungen treten in der Genexpression nach mutagenen Behandlungen auf? Welche Gene sind während der Gehirnentwicklung hochreguliert? Welche Transkripte sind gewebespezifisch und unterscheiden Haut von Muskel? Wie beeinflusst oxidativer Stress das Gen-Spleißen? Welche neuartigen miRNAs sind in menschlichen embryonalen Stammzellen vorhanden? Die Vielseitigkeit von RNA-Seq ermöglicht die Erforschung und Lösung dieser und unzähliger anderer Fragen und unterstreicht damit ihren tiefgreifenden Einfluss auf die biologische Forschung.

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Verschiedene Arten der RNA-Sequenzierung

RNA-Seq-Methoden bieten eine Vielzahl von Vorteilen, die auf unterschiedliche Forschungsfragen und experimentelle Designs zugeschnitten sind. Forscher können die am besten geeignete Methode basierend auf ihren spezifischen Zielen und verfügbaren Ressourcen auswählen.

• mRNA-SequenzierungDiese Technik ermöglicht eine empfindliche und präzise Quantifizierung der Genexpression. Sie identifiziert sowohl bekannte als auch neuartige Isoformen im kodierenden Transkriptom, erkennt Genfusionen und misst allelspezifische Expression.
• Gezielte RNA-SequenzierungFokussiert auf die Analyse der Genexpression in spezifischen Gen-Sets kann dieser Ansatz durch Anreicherungsmethoden oder ampliconbasierte Ansätze erreicht werden, die eine tiefere Untersuchung bestimmter genomischer Regionen ermöglichen.
• Ultra-Niedrig-Input- und Einzelzell-RNA-Seq: Ideal zur Untersuchung des Verhaltens einzelner Zellen in ihrem Mikroumfeld, ist diese Methode von unschätzbarem Wert für das Studium der Zell-Differenzierung, Proliferation und Tumorigenese. Ultra-niedrig-input RNA-Seq ermöglicht die Analyse von winzigen Ausgangsmaterialien, während Einzelzell-RNA-Seq Genexpressionsprofile auf Einzelzellebene enthüllt.
• Gesamt-RNA-SequenzierungDieses Verfahren bietet einen umfassenden Überblick über das Transkriptom, misst präzise die Gen- und Transkriptmenge und erkennt sowohl bekannte als auch neuartige Merkmale in kodierender und nicht kodierender RNA.
• Kleine RNA-SequenzierungFokussiert auf die Sequenzierung kleiner RNA-Spezies wie Mikro-RNAsDiese Technik beleuchtet die Rollen von nicht-kodierender RNA bei der Genstilllegung und der posttranskriptionalen Regulation.
• LncRNA-SequenzierungDurch den Einsatz von Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatischer Analyse untersucht diese Methode die Funktionen und Eigenschaften von langen nicht-kodierenden RNAs und bietet Einblicke in ihre regulatorischen Rollen in zellulären Prozessen.

Bioinformatik-Workflow von RNA-Seq

• RNA-seq-Analysemethoden

Auf der Probenebene untersucht die RNA-Seq-Analyse die Ähnlichkeit der Transkriptome und beleuchtet die molekularen Landschaften verschiedener biologischer Proben. Die Genebene-Analyse konzentriert sich darauf, die kinetischen Prozesse der Genexpression zu entschlüsseln und Einblicke in die dynamische Regulation der Genexpression zu geben. Die Transkriptebene-Analyse umfasst die Rekonstruktion und Quantifizierung von Transkripten und wirft Licht auf die komplexen Spleißmuster und die Vielfalt der Isoformen. Darüber hinaus untersucht die Exonebene-Analyse die Exon-Inklusion bei selektiven Spleißereignissen und entschlüsselt die Komplexität der alternativen Spleißmechanismen.

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• Fortgeschrittene RNA-seq-Analysen

Fortgeschrittene RNA-seq-Analysen umfassen ein Spektrum an anspruchsvollen Techniken, die darauf abzielen, tiefere biologische Einblicke zu gewinnen. Die Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) erläutert komplexe Genregulationsnetzwerke und deckt funktionale Module innerhalb von transkriptomischen Daten auf. Die Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) erkennt biologische Wege, die in differentiell exprimierten Gen-Sets angereichert sind, und bietet Kontext zu transkriptionalen Veränderungen. Die Zeitreihenanalyse zerlegt zeitliche Muster der Genexpression und enthüllt dynamische regulatorische Prozesse. Die Genfusionanalyse identifiziert Fusionstranskripte und bietet Hinweise auf onkogene Ereignisse und strukturelle Variationen. Die RNA-Bearbeitungsanalyse enthüllt post-transkriptionale Modifikationen und beleuchtet regulatorische Mechanismen. Die Protein-Interaktionsnetzwerkanalyse (PINA) kartiert Protein-Protein-Interaktionen und erläutert zelluläre Signalisierungsnetzwerke. Schließlich integriert die Analyse der Visualisierung von Stoffwechselwegen transkriptomische Daten mit Stoffwechselwegen und bietet einen ganzheitlichen Blick auf den zellulären Stoffwechsel und die Funktion.

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