Wie man sein nächstes RNA-Sequenzierungs-Experiment plant

Was ist RNA-Sequenzierung?

RNA-Seq, eine äußerst empfindliche und präzise Technik, hat sich als unverzichtbares Werkzeug zur Untersuchung der Genexpression etabliert und hat bedeutende Durchbrüche in zahlreichen wissenschaftlichen Disziplinen ermöglicht. Während herkömmliche Methoden wie Mikroarray-Mikroarrays ausschließlich bekannte Gene und Transkripte messen, sind sie nicht in der Lage, neuartige Merkmale und unbekannte Transkripte zu erfassen. Im Gegensatz dazu, RNA-Seq nutzt Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie, um RNA-Proben in quantifizierbare DNA-Sequenzen umzuwandeln, wodurch Forscher sowohl etablierte als auch neuartige Merkmale ohne Einschränkungen durch vorheriges Wissen erkennen können.

Ein wesentlicher Vorteil von RNA-Seq ist die Fähigkeit, Heterodimere von Transkripten zu identifizieren, nämlich verschiedene Spleißvarianten, die aus demselben Gen stammen und unterschiedliche Expressionsmuster in verschiedenen Geweben, Entwicklungsstadien oder Krankheitszuständen aufweisen können. Darüber hinaus ermöglicht RNA-Seq die Erkennung von Genfusionsevents, einem Phänomen, das häufig in bestimmten Tumoren beobachtet wird, bei dem zwei oder mehr Gene miteinander verschmelzen. Zudem spielt RNA-Seq eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs), die Variationen in einem einzelnen Nukleotid im Genom darstellen. Solche Varianten haben eine kritische Bedeutung bei der Untersuchung genetischer Unterschiede zwischen Individuen und bei der Identifizierung von Genen, die mit Krankheiten assoziiert sind.

Durch die Bereitstellung von transkriptomweiten Expressionsinformationen ermöglicht RNA-Seq Forschern, komplexe genregulatorische Mechanismen zu entschlüsseln, die Zellfunktion zu verstehen und den Verlauf von Krankheiten zu erläutern. Darüber hinaus erleichtert RNA-Seq vergleichende Analysen von Unterschieden in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen, wie Reaktionen auf therapeutische Medikamente und Anpassungen an unterschiedliche Umweltkontexte.

Bitte lesen Sie unseren Artikel. RNA-Seq zur Analyse der differentiellen Genexpression: Einführung, Protokoll und Bioinformatik für weitere Informationen.

Vorteile der RNA-Sequenzierung

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) mit der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) Technologie bietet mehrere Vorteile für das Studium des Transkriptoms:

• Breiter dynamischer Bereich: RNA-Seq kann die Genexpression über ein breites Spektrum von Expressionsniveaus hinweg erkennen und quantifizieren, von hochabundanten Transkripten bis hin zu seltenen Transkripten. Dies ermöglicht es Forschern, subtile Veränderungen in der Genexpression zu erfassen und schwach exprimierte Gene zu identifizieren, die möglicherweise wichtige biologische Funktionen haben.
• Empfindliche und genaue Messung: RNA-Seq bietet ein hohes Maß an Empfindlichkeit und Genauigkeit bei der Messung der Genexpression. Es kann selbst kleine Veränderungen in den Genexpressionsniveaus erkennen, was es für verschiedene Anwendungen geeignet macht, einschließlich der Analyse der differentiellen Genexpression und der Identifizierung unterschiedlich exprimierter Gene unter verschiedenen Bedingungen.
• Erkennung bekannter und neuer Merkmale: RNA-Seq ermöglicht die Erkennung sowohl bekannter als auch neuer Merkmale ohne vorherige Kenntnisse oder die Notwendigkeit vorgefertigter Sonden. Es kann alternative Spleißisoformen, Genfusionen, ein-nukleotid-Varianten, nicht-kodierende RNAs und andere transkriptomische Merkmale identifizieren, was eine umfassende Erkundung des Transkriptoms ermöglicht.
• Qualitative und quantitative Daten: RNA-Seq erzeugt sowohl qualitative als auch quantitative Daten. Es liefert Informationen über das Vorhandensein oder Fehlen von Transkripten (qualitativ) sowie deren relative Häufigkeit oder Expressionsniveaus (quantitativ). Diese duale Natur der RNA-Seq-Daten ermöglicht es Forschern, Einblicke sowohl in das Vorhandensein verschiedener Transkripte als auch in deren Expressionsmuster zu gewinnen.
• Vollständige Transkriptomabdeckung: Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, die sich auf eine begrenzte Anzahl von Transkripten oder vordefinierten Zielen konzentrieren, bietet RNA-Seq einen umfassenden Überblick über das gesamte Transkriptom. Es erfasst die Expressionsprofile aller transkribierten Gene, einschließlich seltener oder zuvor nicht charakterisierter Transkripte. Dieser unvoreingenommene Ansatz ermöglicht ein gründlicheres Verständnis der Genregulation und transkriptomischen Veränderungen.
• Artenunabhängige Anwendbarkeit: RNA-Seq kann auf jede Art angewendet werden, unabhängig davon, ob eine Referenzsequenz verfügbar ist. Es ist besonders nützlich für das Studium von Nicht-Modellorganismen oder Arten mit begrenzten genomischen Ressourcen. RNA-Seq ermöglicht die de novo Transkriptomassemblierung, bei der das Transkriptom ohne Rückgriff auf ein Referenzgenom rekonstruiert wird, was das Studium neuartiger Arten oder solcher mit komplexen Genomen erleichtert.

RNA-Sequenzierung stärkt die Transkriptomik

Die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) hat die Forschung zum Transkriptom in zahlreichen Bereichen revolutioniert und ermöglicht es Wissenschaftlern, wertvolle Einblicke in die Genexpression, Regulation und funktionale Analyse zu gewinnen. Hier sind einige Möglichkeiten, wie RNA-Seq die Transkriptomforschung in verschiedenen Bereichen vorantreibt:

• KrankheitsforschungRNA-Seq hat erheblich zum Verständnis der molekularen Grundlagen von Krankheiten beigetragen. Durch den Vergleich von Genexpressionsprofilen zwischen gesunden und erkrankten Geweben oder Zelltypen können Forscher unterschiedlich exprimierte Gene identifizieren, die eine Schlüsselrolle bei der Krankheitsentwicklung, dem Fortschreiten oder der Reaktion auf Behandlungen spielen können. RNA-Seq ermöglicht auch die Entdeckung von krankheitsspezifischen transcriptomischen Signaturen und Biomarkern, die bei der Diagnose, Prognose und personalisierten Medizin helfen.
• Arzneimittelreaktion und PharmakogenomikRNA-Seq ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie Zellen oder Gewebe auf Arzneimittelbehandlungen reagieren. Durch die Analyse von Veränderungen der Genexpression nach der Verabreichung von Medikamenten können Forscher molekulare Signalwege identifizieren, die an der Arzneimittelreaktion beteiligt sind, Mechanismen der Arzneimittelresistenz und potenzielle Nebenwirkungen. Darüber hinaus kann RNA-Seq verwendet werden, um interindividuelle Unterschiede in der Arzneimittelreaktion, bekannt als Pharmakogenomik, zu untersuchen, indem Genexpressionsprofile mit Behandlungsergebnissen korreliert werden, was dazu beiträgt, personalisierte Therapien zu leiten.

Anwendungen von RNA-Seq. (Hong et al., 2020)

• Entwicklungsbiologie: RNA-Seq ist entscheidend für das Verständnis der Dynamik der Genexpression während verschiedener Entwicklungsstadien. Durch den Vergleich von Transkriptomen zu unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten können Forscher Gene und Signalwege identifizieren, die an der embryonalen Entwicklung, der Gewebedifferenzierung und der Organbildung beteiligt sind. RNA-Seq kann auch räumliche und zeitliche Ausdrucksmuster sowie regulatorische Netzwerke aufdecken und somit Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der Entwicklung bieten.
• Umweltreaktionen: RNA-Seq ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie Organismen auf verschiedene Umweltbedingungen reagieren, wie z. B. Temperaturänderungen, Exposition gegenüber Schadstoffen oder Verfügbarkeit von Nährstoffen. Durch die Analyse von Genexpressionsmustern können wir Gene und Signalwege identifizieren, die an Stressreaktionen, Anpassung und umweltbezogener Signalübertragung beteiligt sind. Diese Informationen helfen, die molekularen Mechanismen von Umweltreaktionen zu verstehen und können Auswirkungen auf Bereiche wie Ökologie, Landwirtschaft und Naturschutzbiologie haben.
• Genregulationsstudien: RNA-Seq bietet einen umfassenden Überblick über das Transkriptom und ermöglicht das Studium der Genregulation auf verschiedenen Ebenen. Es erlaubt die Identifizierung von alternativen Spleißereignissen, Erkennung von nicht-kodierenden RNAsund die Untersuchung der posttranskriptionalen Regulation. Durch die Integration von RNA-Seq-Daten mit anderen epigenomischen und proteomischen Datensätzen können Forscher ein umfassenderes Verständnis der Genregulationsnetzwerke und der funktionalen Konsequenzen regulatorischer Ereignisse gewinnen.

In Kombination mit anderen Omics-Ansätzen wie Genomik, Epigenomik und Proteomik bietet RNA-Seq ein leistungsstarkes Werkzeug, um die Komplexität der Genexpression und -regulation zu entschlüsseln. Es ermöglicht die Identifizierung funktioneller Elemente, neuartiger Transkripte, regulatorischer Netzwerke und krankheitsassoziierter Signalwege, was letztendlich zu unserem Verständnis biologischer Prozesse und der menschlichen Gesundheit beiträgt.

Anwendungen von RNA-SeqErfahren Sie, wie die RNA-Sequenzierung die Transkriptomforschung in verschiedenen Bereichen vorantreibt.

Wie man RNA-Sequenzierungsmethoden anwendet?

RNA-Seq-Methoden bieten unterschiedliche Vorteile und sind auf verschiedene Forschungsfragen und experimentelle Setups anwendbar. Forscher können die am besten geeignete Methode basierend auf ihren spezifischen Zielen und verfügbaren Ressourcen auswählen.

• mRNA-Sequenzierung: Diese Methode ermöglicht eine empfindliche und genaue Quantifizierung der Genexpression. Sie kann bekannte und neuartige Isoformen im kodierenden Transkriptom identifizieren, Genfusionen nachweisen und allelspezifische Expression messen.
• Gezielte RNA-SequenzierungDieser Ansatz konzentriert sich auf die Analyse der Genexpression in einem spezifischen Satz von interessierenden Genen. Zielgerichtetes RNA-Seq kann durch Anreicherungsmethoden erreicht werden, bei denen RNA-Fragmente, die den Zielgenen entsprechen, vor der Sequenzierung angereichert werden, oder durch ampliconbasierte Ansätze, bei denen spezifische Regionen von Interesse amplifiziert und sequenziert werden.
• Ultra-Niedrig-Eingangs- und Einzelzell-RNA-Seq: Diese Methode wird verwendet, um die Signale und das Verhalten einzelner Zellen in ihrer Umgebung zu untersuchen. Sie ist besonders nützlich für das Studium von Prozessen wie Zell-Differenzierung, Proliferation und Tumorigenese. Ultra-niedrig-eingangs RNA-Seq ermöglicht die Analyse von sehr kleinen Mengen an Ausgangsmaterial, während Einzelzell-RNA-Seq die Charakterisierung der Genexpression in einzelnen Zellen erlaubt.
  Einzelzell-RNA-Sequenzierung Q&AErfahren Sie mehr über das Wissen zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung.
  Einzelzell-RNA-Sequenzierung: Einführung, Methoden und AnwendungenSehen Sie, wie Sie Ihr nächstes scRNA-Seq-Experiment durchführen können.
• Gesamt-RNA-SequenzierungDiese Methode bietet einen umfassenden Überblick über das Transkriptom, indem sie die Gen- und Transkriptmenge genau misst. Sie kann sowohl bekannte als auch neuartige Merkmale in kodierender RNA sowie verschiedene Formen von nicht-kodierender RNA erkennen. Für weitere Details siehe bitte Total RNA-Sequenzierung Fragen und Antworten.
• Kleine RNA-SequenzierungDiese Technik konzentriert sich auf die Isolierung und Sequenzierung kleiner RNA-Spezies, wie z.B. Mikro-RNAs. Sie hilft, die Rolle von nicht-kodierender RNA bei der Genstilllegung und der posttranskriptionalen Regulation der Genexpression zu verstehen.
• LncRNA-SequenzierungUm die Funktionen und Eigenschaften von lncRNAs zu untersuchen, verwenden wir lncRNA-Sequenzierung in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie und bioinformatischer Analyse.

Wie man RNA mit NGS analysiert?

• Extrahiere RNA aus der Probe.
• Bereiten Sie eine RNA-Bibliothek für das Sequenzieren vor.
• Führen Sie NGS durch, um Sequenzierungsreads zu generieren.
• Bioinformatik-Workflow von RNA-Seq.
• Durchführung von Qualitätskontrollen.
• Ausrichten von Reads auf ein Referenzgenom/Transkriptom.
• Quantifizierung von Gen-/Transkriptausdrucksniveaus.
• Durchführung der differentiellen Expressionsanalyse.
• Durchführung einer funktionalen Analyse.
• Interpretieren und visualisieren Sie die Ergebnisse.

Bitte beziehen Sie sich auf Die Technologien und Arbeitsabläufe von RNA-Seq um Ihnen zu helfen, den für Ihre Forschung am besten geeigneten Prozess zu bestimmen.

Referenz:

1. Hong, Mingye, et al. "RNA-Sequenzierung: neue Technologien und Anwendungen in der Krebsforschung." Zeitschrift für Hämatologie und Onkologie 13.1 (2020): 1-16.