Einzelzell-RNA-Sequenzierung: Einführung, Methoden und Anwendungen

Einführung in die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Die Einzelzellsequenzierung nutzt optimierte Next-Generation-Sequencing (NGS)-Technologie, um die Sequenzinformationen einer einzelnen Zelle zu überprüfen. Es gibt eine höhere Auflösung der Zellunterschiede und ein besseres Verständnis der Funktionen einzelner Zellen im Mikroumfeld. Die Sequenzierung der von einer einzelnen Zelle exprimierten RNA kann Einblicke in das Vorhandensein und Verhalten verschiedener Zelltypen geben. Die Population derselben Art scheint genetisch kloniert zu sein, aber die Einzelzell-RNA-Sequenzierung oder die Einzelzell-epigenetische Sequenzierung kann die Variabilität zwischen Zellen aufdecken, was der Population helfen kann, sich schnell an die sich verändernde Umwelt anzupassen.

Der Fortschritt und die Plattformen der Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Im Jahr 2009 wurde die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsmethode (scRNA-seq) entwickelt, als die Sequenzierungsmethoden zunehmend erschwinglicher wurden. Bulk-RNA-Sequenzierung verschleiert normalerweise die Einzigartigkeit und zeigt latente Veränderungen in Zellen nicht. Als Antwort darauf ist scRNA-seq entstanden, um diese Einzigartigkeit zu enthüllen und uns die Biologie der Zellen in einer feineren Auflösung mit definierten Details zu zeigen. Seit ihrer Einführung wurde scRNA-seq angewendet, um die Dynamik von Entwicklungsprozessen zu zeigen, neuartige Zelltypen zu erläutern, zufällige allelische Genexpression zu identifizieren und Mechanismen der Genregulation zu bestimmen. Kommerzielle Plattformen umfassen den Fluidigm C1, Wafergen ICELL8 und die 10X Genomics Chromium.

Abbildung 1. Einzelzellisolierung und Bibliotheksvorbereitung. (Hwang, 2018)

Einzelzell-RNA-Sequenzierungsmethoden

Mehrere Methoden, entweder in voller Länge oder auf Tags basierend, wurden unter scRNA-seq veröffentlicht, wobei jedes Protokoll seine eigenen Vorteile und Anwendbarkeit bietet. Im Allgemeinen umfasst scRNA-seq vier Schritte: (a) Isolation und Lyse einzelner Zellen oder einzelner Kerne aus der extrazellulären Matrix und Zell-Zell-Adhäsion, (b) Reverse Transkription, die normalerweise Oligo-dT-Primer für die Auswahl polyadenylierter mRNAs und lncRNAs verwendet, (c) cDNA-Amplifikation unter Verwendung der SMART-seq- und STRT-Methoden und (d) Vorbereitung der Bibliothekssequenzierung, die üblicherweise unter Verwendung der transposase Tn5-basierten Fragmentierung durchgeführt wird.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsmethode kann auf verschiedene Forschungsinteressen angewendet werden. Bei der Organentwicklung werden scheinbar histologisch identische Gewebe letztendlich in verschiedene Richtungen differenzieren und spezifische Zelltypen mit einzigartigen Funktionen bilden. Durch scRNA-seq würde das Verständnis der einzigartigen Genexpressionsprogramme, die die Differenzierung und Linienentscheidungen in Zellen steuern, unser Verständnis der frühen Organentwicklung verbessern. In der Krebsforschung ermöglicht scRNA-seq, die verschiedenen Zelltyp-Eigenschaften innerhalb und um einen Tumor zu untersuchen. Detaillierte Analysen der Zellheterogenität innerhalb der primären und metastatischen Tumoren deuteten auf die am besten geeignete Behandlung für spezifische Zellkrebsarten hin. Wenn scRNA-seq mit der Ganzzellelektrophysiologie durch Patch-Clamp-Aufzeichnung kombiniert wird, was zu Patch-seq führt, könnten anatomische, morphologische und funktionale Eigenschaften mit der Genexpression verknüpft werden.

Herausforderungen und Anwendungen

Herausforderungen bei der scRNA-seq bestehen darin, mit einer begrenzten Menge an Material (d.h. mRNA) zu arbeiten; daher besteht die Notwendigkeit für Amplifikationsmethoden, die möglicherweise nicht immer linear sind, wie z.B. Verzerrungen und Fehler. Die Einbeziehung von molekularen Barcodes in die scRNA-seq-Technik hilft, dieses Problem zu überwinden. Das Erfassen einzelner Zellen, die Existenz biologischen Rauschens und die Datenanalyse bleiben Hürden für die scRNA-seq-Technologie.

Trotz der verbleibenden Herausforderungen bleibt die Zukunft der scRNA-seq-Technologie vielversprechend. Sie spielt eine Rolle in der räumlichen Transkriptomik, bei der das Transkriptom in intakten Gewebeschnitten, die auf Objektträgern montiert sind, analysiert werden kann, ohne dass eine Zellisolierung aus der extrazellulären Matrix erforderlich ist. Mit Hilfe der Laser-Capture-Mikroskopie/-dissektion könnte das Transkriptom analysiert werden und das in vivo-Szenario in höherem Maße darstellen als andere Methoden, die eine Dissoziation erfordern. Darüber hinaus ermöglicht scRNA-seq die Identifizierung von Biomarkern und Arzneimittelzielen, was die Präzisionsmedizin weiterentwickelt und den Abschluss des menschlichen Zellatlas vorantreibt. Schließlich führte die kombinierte Profilierung des Genoms, Transkriptoms und Epigenoms aus einer einzelnen Zelle zu Methoden wie "DRseq", "scTrio-seq" und "scM&T-seq".

Referenzen:

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