Anwendungen von RNA-Seq

Was ist RNA-Seq?

Die Regulierung der Genexpression ist grundlegend, um Genotypen mit Phänotypen zu verknüpfen. RNAs formen komplexe Netzwerke der Genexpression, die biologische Prozesse steuern. Ein tiefgehendes Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen, wie man diese komplexen Netzwerke der Genexpression steuert, ist entscheidend für die Behandlung komplexer Krankheiten wie Krebs. Hybridisierungsbasierte Mikroarrays werden verwendet, um die gleichzeitige Überwachung der Expressionsniveaus annotierter Gene in Zellpopulationen zu ermöglichen. Allerdings haben sich genomweite Ansätze als wertvoller erwiesen, um Einblicke in Transkriptome zu gewinnen. Diese nächsten/dritten Sequenzierungsplattformen ermöglichen die schnelle und kosteneffiziente Generierung massiver Mengen an Sequenzdaten. Das RNA-Profiling unter Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ist bekannt als RNA-Seq.

Vorteile von RNA-Seq

• Umfang: Die umfassende Natur von RNA-Sequenzierung ermöglicht die umfassende Erkennung aller Transkripte innerhalb der Probe, einschließlich protein-codierender mRNAs, nicht-codierender RNAs (wie miRNAs, lncRNAs usw.) und Isoformen von Transkripten. Diese umfassende Abdeckung trägt dazu bei, ein gründlicheres Verständnis der Komplexität der Regulation der Genexpression zu erlangen.
• Hohe Empfindlichkeit: Die hohe Empfindlichkeit von RNA-Sequenzierung Technologie ermöglicht die Erkennung von RNA-Molekülen in geringer Menge, was die Entdeckung von Genen und Transkripten mit niedriger Expression sowie die Erkennung von minimalen Ausdrucksvariationen ermöglicht. Folglich erlaubt dies einen umfassenderen Überblick über den biologischen Zustand von Zellen oder Geweben.
• Quantifizierung: RNA-Seq bietet quantitative Einblicke in die Ebenen der Genexpression und ermöglicht eine präzise Messung der manifesten Mengen verschiedener Gene und Transkripte. Dieser Ansatz erlaubt eine vergleichende Analyse, die die Erforschung von Variationen in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen sowie die Quantifizierung der Intensitäten der Genregulation ermöglicht.
• Entdeckung neuer Gene und Transkripte: RNA-Seqagnostisch gegenüber Vorwissen, eröffnet Möglichkeiten zur Entdeckung neuer Gene und Transkripte, einschließlich unannotierter oder wenig verbreiteter RNA-Moleküle. Dies kann helfen, neuartige funktionale Gene und regulatorische Elemente zu entdecken und die Tiefe und Breite der Genomforschung zu erweitern.
• Erkennung von RNA-Bearbeitung und Modifikationen: RNA-Sequenzierung ermöglicht die Erkennung von RNA-Bearbeitungen und -Modifikationen wie RNA-Spleißung, RNA-Bearbeitung und RNA-Methylierung unter anderem. Diese RNA-Modifikationsereignisse haben erhebliche Auswirkungen auf die Genfunktion und -regulation, sodass die RNA-Sequenzierung die Dynamik der RNA auf der Ebene der post-transkriptionalen Modifikation aufdecken kann.
• Einzelzell-Analyse: Modernste RNA-Sequenzierungstechniken sind auf Einzelzellebene anwendbar und ermöglichen die Analyse von Genexpressionsprofilen einzelner Zellen. Dieser Ansatz bietet Einblicke in Variationen der Genexpression über verschiedene Zelltypen und Bedingungen hinweg und offenbart zudem die Funktionalität und Eigenschaften einzelner Zellen.
• Flexibilität im experimentellen Design: RNA-Sequenzierung Die Technologie bietet erhebliche Flexibilität im experimentellen Design und berücksichtigt eine Vielzahl von Probenarten und experimentellen Bedingungen. Dazu gehören verschiedene biologische Entitäten, Gewebe und Zelltypen sowie die Analyse der Genexpression unter verschiedenen Behandlungsbedingungen.

Anwendungen von RNA-Seq

Seit RNA-Seq ist quantitativ, es ist nützlich, um RNA-Expressionsniveaus zu bestimmen. Neben dieser grundlegenden Funktion kann RNA-Seq für die differenzielle Genexpression, die Erkennung von Varianten und die allelspezifische Expression verwendet werden, kleine RNA-ProfilierungCharakterisierung alternativer Spleißmuster, Systembiologie, Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Entwicklung von SNPs und SSRs usw.

RNA-SeqDie Nutzung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie ermöglicht eine umfassende cDNA-Bibliothekssequenzierung aller RNAs, die innerhalb einer Zell- oder Gewebeprobe transkribiert werden. Dieser Ansatz erlaubt die quantitative Bewertung der spezifischen RNA-Expression durch Zählen der entsprechenden Lesezahlen, was bei der Entdeckung neuer Transkripte hilft. Vorrausgesetzt, es gibt ein Referenzgenom, können diese Transkripte wieder dem Genom zugeordnet werden, was das Verständnis umfassender genetischer Informationen, wie z.B. Transkriptstandorte und Spleißmuster, verbessert. Diese weit verbreitete Technik ist integraler Bestandteil verschiedener Bereiche, einschließlich biologischer Forschung, medizinischer Studien, klinischer Forschung und pharmazeutischer Entwicklung, und bereichert unser Verständnis und die Anwendung der genomischen Wissenschaften erheblich.

Abbildung 1. Übersicht über die typische RNA-seq-Analyse-Pipeline (Han et al. 2015).

Differenzielle Genexpression

Eine wichtige Anwendung von RNA-Seq Der Vergleich von Transkriptomen über verschiedene Entwicklungsstadien, Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg. Diese Analyse, auch bekannt als Analyse der differentiellen Genexpression, erfordert die Identifizierung von Genen sowie deren Isoformen und eine präzise Bewertung ihrer Expressionsniveaus. Es ist wichtig, funktionale Elemente des Genoms darzustellen und die biologischen Mechanismen von Entwicklung und Krankheit aufzudecken.

Die gängigen Werkzeuge für die differenzielle Genexpression umfassen Cuffdiff, DESeq, DESeq2, EdgeR, PoissonSeq, Limma voom und MISO.

Variantenentdeckung und allelspezifische Expression

RNA-Seq ermöglicht die Identifizierung von Varianten und allelspezifischer Expression. Einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) beziehen sich auf die Variation eines einzelnen Nukleotids, die an einer bestimmten Stelle im Genom auftritt, was zu allelspezifischer Expression (ASE) führen kann. ASE bedeutet, dass eines von zwei Allelen stark in mRNA transkribiert wird, während das andere gering oder sogar gar nicht transkribiert wird. Neuere Studien haben auch ASE mit der Anfälligkeit für eine Reihe von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. RNA-Seq und Whole-Genome-DNA-Sequenzierung (WGS) Ermöglicht die Identifizierung häufiger Krankheitsvarianten, einschließlich SNPs und ASE.

Die gängigen Werkzeuge zur Variantenentdeckung sind GATK, ANNOVAR, SNPiR, SNiPlay3.

Klein-RNA-Profilierung

Kleine RNA Arten beinhalten im Allgemeinen Mikro-RNA (miRNA), kleine interferierende RNA (siRNA) und piwi-interagierende RNA (piRNA) sowie andere Arten von kleinen RNA, wie kleine nucleoläre RNA (snoRNA) und kleine nukleäre RNA (snRNA). Kleine RNAs spielen eine Rolle bei der Genstilllegung und der posttranskriptionalen Regulation der Genexpression. Es wurde nachgewiesen, dass kleine RNAs an biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Entwicklung, Zellproliferation und Differenzierung sowie Apoptose. Die meisten anfänglichen kleine RNA Entdeckungsstudien verwendeten Pyrosequenzierung und anschließend andere NGS-Plattformen mit höherem Durchsatz, was zu genomweiten Erhebungen und der Entdeckung einer zunehmenden Anzahl von kleinen RNA-Spezies führte. Häufige bioinformatische Werkzeuge für kleine RNA-Sequenzierung Die Daten sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1. Vergleich von sRNA-seq-Webanwendungen (Rahman et al. 2018).

Charakterisierung von alternativen Spleißmustern

Alternative Spleißmuster sind wichtig, um die Entwicklung und menschliche Krankheiten zu verstehen, da veränderte Spleißmuster zur Entwicklung, Zell-Differenzierung und menschlichen Krankheiten beitragen. RNA-Seq ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Charakterisierung alternativer Spleißmuster. Das Paar-End-Sequenzieren ermöglicht Sequenzinformationen von beiden Enden, wodurch Spleißmuster erkannt werden, ohne dass vorherige Kenntnisse über Transkriptannotationen erforderlich sind. PacBio SMRT-Sequenzierung ermöglicht die Untersuchung von Spleißmustern und Transkriptverbindungen auf eine unvoreingenommene und genomweite Weise durch die Generierung von Vollständige Transkriptsequenzen.

Die gängigen Werkzeuge zur Charakterisierung alternativer Spleißmuster umfassen TopHat, MapSplice, SpliceMap, SplitSeek, GEM Mapper, SpliceR, SplicingCompass, GIMMPS, MATS und rMATS.

Abbildung 2. RNA-Seq zur Erkennung alternativer Spleißereignisse (Ozsolak und Milos 2011).

Systembiologie

Die Erstellung von Listen differentiell exprimierter (DE) Gene ist nicht der letzte Schritt von RNA-Seq Analyse. Weitere biologische Einblicke in ein experimentelles System können gewonnen werden, indem man die Ausdrucksänderungen von Gen-Sets betrachtet. Dieser Prozess, bekannt als Systembiologie, basiert auf dem Verständnis, dass das Ganze mehr ist als die Summe seiner Teile. Die Analyse von Signalwegen und die Analyse von Co-Expressionsnetzwerken sind zwei wichtige Bestandteile.

Tabelle 2. Die Werkzeuge für die Pfadanalyse und die Co-Expressionsnetzwerkanalyse unter Verwendung von RNA-seq-Daten.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung bietet Möglichkeiten, das Zusammenspiel zwischen intrinsischen zellulären Prozessen und extrinsischen Stimuli bei der Bestimmung des Zellschicksals zu untersuchen. Sie trägt auch zu einem besseren Verständnis dafür bei, wie eine „Ausreißerzelle“ den Ausgang einer Infektion bestimmen kann. Darüber hinaus können die meisten lebenden Zellen nicht in vitro kultiviert werden; die Einzelzell-RNA-Sequenzierung könnte neuartige Arten oder regulatorische Prozesse von biotechnologischer oder medizinischer Relevanz entdecken. Der Workflow der Einzelzell-RNA-Sequenzierung umfasst in der Regel die folgenden Schritte: Einzelzellisolierung, cDNA-Bibliothekskonstruktion, RNA-Seqund Bioinformatik (Abbildung 2).

Abbildung 3. Der allgemeine Arbeitsablauf von Einzelzell-RNA-Seq.

Anwendungen der Einzelzell-RNA-Sequenzierung:

• Stammzell-Differenzierung
• Embryogenese
• Ganzgewebeanalyse
• Einzelzell-RNA-Sequenzierung für Studien am gesamten Organismus
• Krankheitsbiologie und Behandlung

Entwicklung von SNPs und SSRs

RNA-Seq ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das genutzt werden kann, um Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) innerhalb von Genomen zu erkennen und zu identifizieren. Durch den Vergleich und die Analyse der transkriptomischen Daten verschiedener Individuen oder Populationen können wir SNP-Standorte innerhalb verschiedener Genome genau bestimmen und diese anschließend überprüfen und validieren. Dieser Prozess unterstützt unser Verständnis der genetischen Divergenz zwischen einzelnen Organismen und bietet eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen zu den Beziehungen zwischen Genotypen und Phänotypen. Darüber hinaus kann RNA-seq auch eingesetzt werden, um einfache Sequenzwiederholungen (SSRs) innerhalb der genomischen Struktur zu entdecken und zu untersuchen. SSRs, die aus wiederholten DNA-Sequenzen bestehen, die im Genom vorkommen, sind von entscheidender Bedeutung für genetische Markierungen und die Forschung zur Populationsgenetik. Durch die Analyse von RNA-Sequenzdaten können wir Gene und Transkripte identifizieren, die SSRs enthalten, und damit wichtige Grundlagen für Studien zur genetischen Vielfalt und Evolution legen.

Nutzung RNA-Seq Daten, wir sind in der Lage, ein zu konstruieren ein genetische Karte des Genoms – wodurch die Verteilung der Genloci und das Ausmaß der genetischen Vielfalt offenbart werden. Durch die Analyse von RNA-Sequenzen aus verschiedenen Individuen oder Populationen sind wir nicht nur in der Lage, eine Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp herzustellen, sondern auch die Funktion von SNPs und SSRs im Genom sowie deren evolutionäre Bedeutung abzuleiten. RNA-seq ermöglicht es uns zudem, die genetischen Unterschiede zwischen verschiedenen Germplasmressourcen und Sorten zu identifizieren und zu authentifizieren. Durch den vergleichenden Analyse der Transkriptomdaten aus unterschiedlichen Germplasma oder Sorten können wir SNPs und SSRs aufdecken, die spezifische genotypische oder phänotypische Merkmale tragen. Daher legt dies eine Grundlage für die Sammlung, Erhaltung und Nutzung von Germplasmressourcen.

Anwendung von RNA-Seq in der Krebs- und anderen Krankheitsforschung

RNA-Seq ist in verschiedenen Aspekten der Krebsforschung und -therapie tätig gewesen, einschließlich der Entdeckung und Charakterisierung von Biomarkern, die die Heterogenität und Evolution von Krebs, Arzneimittelresistenz, immunologische Mikroumgebungen in Krebs und Immuntherapie sowie Neoantigene detaillieren. Besonders bemerkenswert ist, dass Genfusionen untrennbar mit der Tumorigenese verbunden sind und als ideale Krebsbiomarker und therapeutische Ziele dienen, die überwiegend durch RNA-CaptureSeq in klinischen Proben nachgewiesen werden. Neben nukleinsäurebasierten Biomarkern hat die Integration von RNA-seq mit Immunhistochemie und Proteinblots die Identifizierung bestimmter Proteine als Krebsbiomarker bestätigt. Zum Beispiel hat die Kombination von nukleärem COX₂ (Cyclooxygenase-2) und HER2 (Humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2) haben sich als potenzieller Biomarker für Krebs herausgestellt, insbesondere bei der Diagnose von kolorektalem Krebs und der Vorhersage seiner Prognose. RNA-Seq kann frühe Mutationen und hochriskante Polymorphismen erkennen, was zur Entdeckung neuer Krebsbiomarker und potenzieller therapeutischer Ziele führt, und somit Krankheiten überwacht und gezielte Therapien bei frühen Behandlungsentscheidungen leitet. Zum Beispiel hat die Einzelzell-RNA-Sequenzierung bei Brustkrebs gezeigt, dass tumorinfiltrierende immunsuppressive unreife myeloische Zellen zur Arzneimittelresistenz beitragen.

Abbildung 4. Anwendungen von RNA-seq in der Analyse der differentiellen Expression und Krebs-Biomarkern, Krebs-Heterogenität und Arzneimittelresistenz, immunologischer Mikroumgebung von Krebs, Immuntherapie und Neoantigen. (Hong et al., 2020)

Durch die Anwendung von RNA-Sequenzierung (RNA-seq)Wir können zur Enthüllung der Mechanismen, die dem Ausbruch von Krankheiten zugrunde liegen, beitragen, die Präzision in der Krankheitsdiagnostik verbessern, die Wirksamkeit von Behandlungen bewerten und neuartige Behandlungsziele identifizieren. Durch eine vergleichende Analyse von transkriptomischen Daten aus Patientenproben und Standardkontrollgruppen mittels RNA-seq ist es möglich, Unterschiede in der Genexpression zu erkennen, die mit dem Ausbruch und dem Fortschreiten von Krankheiten verbunden sind, und damit potenzielle Krankheitsmechanismen aufzudecken. Bei der Identifizierung von Biomarkern, die mit verschiedenen Krankheiten in Zusammenhang stehen, spielt RNA-seq eine entscheidende Rolle. Durch die Untersuchung der transkriptionalen Daten von Patientenproben können spezifische Muster der Genexpression, die mit Krankheitszuständen korreliert sind, aufgedeckt werden. Diese Enthüllung neuartiger Biomarker hat erhebliche Auswirkungen auf die frühzeitige Krankheitsdiagnostik und die prognostische Bewertung. Darüber hinaus kann RNA-seq eingesetzt werden, um neue therapeutische Ziele zu identifizieren, personalisierte Behandlungspläne zu leiten und immuntherapeutische Strategien zu informieren. Abgesehen von seiner Anwendung in der Krebsforschung hat RNA-seq auch breite Anwendung in der Untersuchung zahlreicher anderer Krankheiten gefunden, einschließlich kardiovaskulärer Erkrankungen, neurologischer Störungen und Autoimmunerkrankungen. Die Untersuchung und Analyse von patientenabgeleiteten transkriptomischen Daten ebnen den Weg zu einem tieferen Verständnis der Krankheitsmechanismen, was wiederum neue Perspektiven und Strategien für die Krankheitsdiagnose und -behandlung bietet.

Anwendung von RNA-Seq in der Biologie

Einstellen RNA-Seq, eine Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie, hat erhebliche Auswirkungen auf verschiedene biologische Bereiche. Die Anwendungen von RNA-seq in der Biologie umfassen hauptsächlich die Analyse der Genexpression, die Forschung zu nicht-kodierenden RNAs, epigenetische Studien, die Forschung zur molekularen Evolution und die funktionelle Genomforschung. Durch die Messung der mRNA-Expressionsniveaus auf Transkriptomebene können unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich exprimierte Gene identifiziert werden, was die Aufdeckung von Genregulationsnetzwerken und Signalwegen ermöglicht. RNA-seq kann die Entdeckung und Analyse von nicht-kodierenden RNAs erleichtern, wie zum Beispiel miRNAs und lncRNAs, die eine wesentliche Rolle bei der Genregulation, Epigenetik und dem Auftreten von Krankheiten spielen. Im Hinblick auf die Forschung zur molekularen Evolution können RNA-Seq-Daten verwendet werden, um die Genexpressionsspektren zwischen verschiedenen Arten oder Populationen zu vergleichen und somit die Evolution und Differenzierung der Genfunktion zu untersuchen. Darüber hinaus dient RNA-Seq dazu, funktionale Gene und regulatorische Elemente im Genom zu identifizieren und funktionell zu interpretieren.

Durch die Nutzung von RNA-seq-Daten können umfassende Forschungen zu mikrobiellen pathogenen Mechanismen durchgeführt werden. RNA-seq ermöglicht es uns, transkriptionale Regulationsnetzwerke in Mikroben zu konstruieren und die Beziehungen zwischen regulatorischen Faktoren und pathogenitätsassoziierten Genen aufzudecken. Die Identifizierung von Genen, die Virulenzfaktoren und Mechanismen der Immunflucht in Mikroben kodieren, trägt erheblich zu unserem Verständnis der Pathogenese bei, da diese Gene oft entscheidende Rollen bei mikrobiellen Invasionen und der Umgehung des Immunsystems spielen. Wichtig ist, dass RNA-seq auch die Forschung zur mikrobiellen Resistenz gegen Antibiotika erleichtern kann. Eine Analyse der mikrobiellen transkriptomischen Veränderungen nach einer Antibiotikabehandlung kann Aufschluss über die Gene und Signalwege geben, die an der Entwicklung von Resistenzen beteiligt sind. Darüber hinaus kann diese Technologie die Veränderungen der Genexpression in Wirtszellen während eines mikrobiellen Infektionsprozesses untersuchen, was Einblicke in die Mechanismen der mikrobiellen Invasion, die Immunantworten des Wirts und die molekularen Interaktionen, die am pathogenen Prozess beteiligt sind, liefern kann.

Anwendung von RNA-Seq in der Landwirtschaft

RNA-Seq hat tiefgreifende Anwendungen in der Landwirtschaft gefunden, insbesondere bei der Untersuchung von Tier- und Pflanzenkrankheiten, der Erforschung der Widerstandsfähigkeit und Anpassungsfähigkeit von Pflanzen sowie der Weiterentwicklung der molekularen Züchtung. Durch RNA-Seq können wir Veränderungen der Genexpression in infizierten Tier- und Pflanzengeweben bewerten, um krankheitsresistenzbezogene Gene zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht RNA-Seq die Erforschung physiologischer und metabolischer Veränderungen während des Ausbruchs von Krankheiten, wodurch deren Pathophysiologie aufgeklärt wird. RNA-Seq kann entscheidend sein, wenn es darum geht, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, durch die Pflanzen Umweltstressoren entgegenwirken. Durch die Untersuchung von Veränderungen der Genexpression in Pflanzen unter widrigen Bedingungen können wir stressresistenzbezogene Gene identifizieren. Dies liefert eine theoretische Grundlage für die selektive Züchtung neuer Pflanzenvarianten, die an unterschiedliche Umweltbedingungen angepasst sind. Darüber hinaus ermöglicht RNA-Seq die Analyse der Korrelation zwischen umfangreichen Genexpressionsdaten und phänotypischen Merkmalsdaten, wodurch Genotyp-Phänotyp-Assoziationsstudien erleichtert werden. Dies ist entscheidend für die Identifizierung funktioneller Gene, die mit Zielmerkmalen assoziiert sind, und bietet potenzielle molekulare Marker sowie genetische Hintergrundinformationen für die molekulare Züchtung.

Die Ergebnisse von RNA-Seq Die Analyse kann genutzt werden, um molekulare Marker für den Einsatz in der markergestützten Selektion (MAS) in der Pflanzenzüchtung zu entwickeln. Dieser Ansatz trägt zur Verbesserung der Züchtungseffizienz bei und beschleunigt die Auswahl und Verbreitung günstiger Gene. Darüber hinaus kann RNA-seq Veränderungen der Genexpression während der Interaktion zwischen Pflanzen und pathogenen Mikroorganismen oder Schädlingen aufklären, was zum Verständnis der molekularen Mechanismen beiträgt, die der Pflanzenkrankheit und der Schädlingsresistenz zugrunde liegen. Dies bietet neuartige Ziele und Strategien für das Management von Krankheiten und Schädlingen. RNA-seq wird auch eingesetzt, um die transkriptionalen Regulationsnetzwerke zu untersuchen, die an der Interaktion zwischen Pflanzen und nützlichen Mikroorganismen beteiligt sind. Es hilft, die fördernden Effekte von Bio-Düngemitteln auf das Pflanzenwachstum und die Nährstoffaufnahme zu identifizieren, wodurch der Ertrag und die Qualität der Pflanzen erhöht werden.

Wenn Sie mehr Informationen über RNA-Seq wünschen, beziehen Sie sich bitte auf die folgenden Artikel:

Bioinformatik-Workflow von RNA-Seq
Die Technologien und Arbeitsabläufe von RNA-Seq

Referenzen:

1. Ozsolak F, Milos P M. RNA-Sequenzierung: Fortschritte, Herausforderungen und Chancen. Nature Reviews Genetics, 2011, 12(2): 87.
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