Was ist die Analyse alternativer Spleißung?

Was ist alternatives Spleißen?

Alternative SplicingEin entscheidender Mechanismus in der Regulation der Genexpression bei Eukaryoten trägt erheblich zur Erweiterung der funktionalen Vielfalt innerhalb von Genen bei. Dieser Prozess umfasst das selektive Spleißen von interagierenden Exons und Introns in biologischen Gensequenzen, wodurch ein einzelnes Gen mehrere Transkripte erzeugen kann. Jedes Transkript weist unterschiedliche Spleißstellen in der kodierenden Sequenz auf, was zur Produktion von Proteinen mit unterschiedlichen Funktionen führt.

Ungefähr 95 % der Gene unterliegen alternativer Spleißung, was dazu führt, dass Zellen etwa vier Isoformen pro Gen exprimieren. Alternative Spleißung äußert sich in fünf Haupttypen:

• Exon-Auslassung (EA)
• Alternative 5'-Spleißstelle (A5SS)
• Alternativer 3' Spleißstelle (A3SS)
• Wechselseitig ausschließender Exon
• Intron-Retention (IR)

Analyse der alternativen Spleißung in der RNA-Sequenzierung

In den letzten Jahren, massiv parallele RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) hat sich als ein leistungsstarkes Werkzeug für die Durchführung umfassender transcriptomischer Analysen etabliert. Die sinkenden Kosten der Tiefensequenzierung haben großangelegte Untersuchungen zur Genexpression und alternativen Spleißung erleichtert, was zu einem Anstieg der Identifizierung von Krankheiten geführt hat, die mit diesen Spleißvariationen verbunden sind. Das aus diesen Studien gewonnene Wissen birgt großes Potenzial für die Entwicklung präventiver und therapeutischer Interventionen.

Die präzise Kartierung und Quantifizierung von alternativen Spleißereignissen sind entscheidend für nachgelagerte Analysen, insbesondere bei der Korrelation von Krankheiten mit spezifischen Spleißmustern. Trotz der weit verbreiteten Annahme von Hochdurchsatz-RNA-SeqDie genaue Unterscheidung der Homodimer-Expression und die Gewinnung quantitativer Ergebnisse für alternatives Splicing aus den resultierenden Daten stellen weiterhin Herausforderungen dar.

In RNA-Seq-Experimenten wird mRNA aus Geweben extrahiert, fragmentiert und in cDNAs umgeschrieben. Die anschließende Amplifikation und Sequenzierung mittels hochdurchsatzfähiger, kurzzeitiger Sequenzierungsmethoden erzeugt Sequenzierungsdaten aus Gewebeproben. Idealerweise können die Transkriptom-Leseabschnitte mithilfe von Vergleichssoftware zusammengefügt werden, um die transkribierte genomische Region zu rekonstruieren. Alternative Spleißereignisse können dann mit spezieller Analysesoftware identifiziert und quantifiziert werden.

Jedoch bestehen technische Einschränkungen, die hauptsächlich auf die begrenzten Lese-längen zurückzuführen sind, die bei der RNA-Sequenzierung der nächsten Generation (typischerweise zwischen 50 bp und 150 bp) auftreten. Die Herausforderung verstärkt sich, wenn versucht wird, Transkript-Isoformen desselben Gens zu unterscheiden, da kurze Leseabschnitte selten über Spleißstellen hinweg reichen. Diese Komplexität erschwert die Ableitung von Vollständige Transkripteinsbesondere für Transkripte mit niedriger Expression. Darüber hinaus bleibt die Identifizierung von Transkriptionsstart- und -terminierungsstellen eine erhebliche Herausforderung.

Bitte lesen Sie unseren Artikel. PacBio Iso-Seq ermöglicht eine tiefgehende Erforschung des alternativen Spleißens., für weitere Informationen.

Alternative Spleißanalyse in der Einzelzell-Sequenzierung

Die Nutzung von Software zur Analyse alternativer Spleißvarianten bei Einzelzell-Daten bietet wertvolle Einblicke in verschiedene alternative Spleißstellen und die damit verbundenen Gene innerhalb jeder Subpopulation oder Probe. Die anschließende differentiellen Analyse hilft, wichtige alternative Spleißstellen über verschiedene Subpopulationen hinweg oder Gene zu identifizieren, die mit spezifischen Phänotypen verbunden sind. Diese Untersuchung ermöglicht es Forschern, die komplexen Zusammenhänge zwischen den Stellen alternativer Spleißereignisse und verschiedenen Zelltypen oder Phänotypen zu entschlüsseln.

Bei der Bewertung von alternativem Spleißen ist es entscheidend, die gleichmäßige Verteilung der cDNA-Reads über das gesamte Gen zu berücksichtigen. Eine uniforme Verteilung weist auf eine hohe Zufälligkeit bei der Bindung der erfassten Sequenzen hin, was eine vollständige Abdeckung der mRNA ermöglicht – eine wesentliche Voraussetzung für eine genaue Analyse des alternativen Spleißens.

Während Einzel-End-Einzelzell-Transkriptome bestimmte Informationen zu alternativen Spleißstellen erfassen können, schränkt die Anreicherung am Einzel-End die verfügbare Informationsmenge ein. Diese Einschränkung behindert die umfassende Erklärung alternativer Spleißisoformen und der nachfolgend kodierten Proteine des Gens.

Werkzeuge zur genauen Quantifizierung von alternativem Spleißen

Im vergangenen Jahrzehnt wurden computergestützte Werkzeuge entwickelt, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Angesichts der Betonung des Autors auf ereignisbasierten Methoden und deren fortgesetzter Nutzung folgt eine kurze Übersicht über sechs bemerkenswerte Softwarelösungen zur Analyse alternativer Spleißung: rMATS, MAJIQ, LeafCutter, SUPPA2, SplAdder und Whippet.