Alternative Spleißung
Alternatives Splicing ist ein grundlegender zellulärer Prozess, der es einem einzelnen Gen ermöglicht, für multiple Proteinisoformen zu kodieren, wodurch die funktionale Vielfalt des Proteoms erheblich erweitert wird. Eine genaue Charakterisierung von Alternativen Splicing-Ereignissen ist entscheidend für das Verständnis der Genregulation, gewebespezifischer Funktionen und Krankheitsmechanismen.
Traditionelle Kurzlese-Sequenzierungstechniken sind zwar in vielen Kontexten effektiv, erreichen jedoch oft nicht die präzise Erfassung der komplexen Landschaft des alternativen Spleißens aufgrund der Einschränkungen durch kurze Lese-längen und hohe Sequenzierungsfehlerquoten. Die Iso-Seq-Technologie von PacBio hat sich als leistungsstarkes Werkzeug für die umfassende Transkriptomanalyse etabliert und bietet Hochdurchsatz- Langzeit-Sequenzierung das die Erforschung des alternativen Spleißens mit beispielloser Genauigkeit und Tiefe erleichtert.
Neueste Studien haben überzeugend gezeigt, dass über 90 % der menschlichen Gene umfangreiche alternative Spleißvorgänge durchlaufen, die eine vielfältige Palette von Isoformen erzeugen. Bemerkenswerterweise weisen bestimmte Gene ein erstaunliches Repertoire von mehr als 10 Isoformen auf. Gleichzeitig haben diese dynamischen Spleißmuster häufig entscheidende Auswirkungen auf Wachstum, Krankheitsanfälligkeit, Tumorentstehung und verschiedene Krebsarten. Erstaunlicherweise erfassen herkömmliche Methoden der Kurzlesesequenzierung oft einen erheblichen Teil – zwischen 60 % und 80 % – dieser komplexen transcriptomischen Nuancen nicht. Betreten Sie die Iso-Seq Untersuchung, die auf der genialen PacBio-Technologie basiert, die eine aufschlussreiche Lösung bietet, indem sie die umfassende Erkennung von vollständigen cDNA-Molekülen ermöglicht und unsere Fähigkeit erheblich erweitert, diese schwer fassbaren Isoformen zu entdecken.
Fallstudie 1: Iso-Seq zeigt Transkriptvielfalt bei Brustkrebs
Brustkrebs ist eine heterogene Erkrankung, die durch eine Vielzahl von Transkriptomveränderungen gekennzeichnet ist, die zum Tumorwachstum und zu den Behandlungsergebnissen der Patienten beitragen. Ein wichtiger Mechanismus, der der Transkriptomvielfalt zugrunde liegt, ist das alternative Spleißen, das aus einem einzelnen Gen mehrere mRNA-Isoformen erzeugt. Das vollständige Spektrum der isoform-spezifischen Spleißuntertypen bei Brustkrebs ist jedoch weitgehend unbekannt. Traditionelle Methoden der Kurzlesesequenzierung haben Einschränkungen bei der genauen Erfassung von Voll-Längen-Isoformen und der Identifizierung tumorspezifischer Spleißereignisse. In dieser Fallstudie hatten die Forscher das Ziel, umfassend Voll-Längen-Isoformen und tumorspezifische Spleißereignisse bei Brustkrebs mithilfe von drei Generationen der Iso-seq-Technologie zu identifizieren und zu annotieren.
Die Studie verwendete die Iso-seq-Technologie, die auf der Einzelmolekül-Langlesesequenzierung basiert. Dieser Ansatz ermöglicht die direkte Sequenzierung von vollständigen cDNAs, wodurch die Identifizierung vollständiger Isoformen und die genaue Erkennung komplexer Spleißereignisse ermöglicht wird. Die Forscher erhielten Brustkrebsproben von einer vielfältigen Kohorte von Patienten, die verschiedene Brustkrebsuntertypen repräsentieren. Sie führten die Iso-seq-Sequenzierung an diesen Proben durch und erzeugten hochwertige Langlese-transkriptomische Daten.
Um vollständige Isoformen zu identifizieren und zu annotieren, entwickelten die Forscher eine bioinformatische Pipeline, die Fehlerkorrektur, Isoform-Clustering und die Generierung von Konsenssequenzen umfasste. Sie nutzten auch Referenzgenomannotationen, um zwischen bekannten und neuartigen Isoformen zu unterscheiden. Um tumor-spezifische Spleißereignisse zu identifizieren, wurden die Isoform-Expressionsprofile von Tumorproben mit normalen Gewebeproben verglichen.
LR-seq identifiziert zuvor unentdeckte Isoformen bei Brustkrebs. (Veiga et al., 2022)
Erstaunlicherweise wiesen 30 % dieser neuartigen Isoformen Veränderungen auf, die protein-codierende Exons betrafen, was auf die potenzielle funktionale Bedeutung dieser Isoformen in der Tumorbiologie hinweist. Umfassende Kreuzvalidierungen der identifizierten Isoformen und Spleißereignisse wurden durchgeführt, um die Robustheit der Ergebnisse zu erhöhen.
Insgesamt identifizierten die Forscher 3.059 brusttumorspezifische Spleißereignisse, die zuvor nicht charakterisiert waren. Bemerkenswert ist, dass 35 dieser Spleißereignisse signifikant mit dem Überleben der Patienten assoziiert waren, was auf ihr Potenzial als prognostische Marker hinweist. Unter diesen Genen waren 21 in bestehenden Datenbanken und der Literatur nicht vorhanden, was die Leistungsfähigkeit des Langlese-Sequenzierens bei der Entdeckung neuartiger transkriptomischer Merkmale unterstreicht. Darüber hinaus wurden 10 Gene gefunden, die in spezifischen Brustkrebs-Subtypen angereichert waren, was Einblicke in die subtyp-spezifische Spleißlandschaft bietet.
Fallstudie 2: Iso-Seq zeigt Promotervielfalt in verschiedenen Subtypen von Magenkrebs
Dysregulierte Genexpression ist ein charakteristisches Merkmal von Krebs und spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorentwicklung und -progression. Traditionelle Methoden zur Analyse der Genexpression, die oft auf der Sequenzierung der zweiten Generation basieren, sind durch ihre Unfähigkeit, vollständige Transkripte zu erfassen, eingeschränkt, wodurch wichtige Informationen über die tatsächliche transkriptionale Landschaft in Krebszellen möglicherweise verloren gehen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine umfassende Studie durchgeführt, um das transkriptionale Profil von Magenkrebs (GC) mithilfe einer Kombination aus Iso-seq- und RNA-seq-Technologien zu untersuchen. Ziel dieser Studie war es, die Vielfalt der Promoternutzung und des alternativen Spleißens über verschiedene Subtypen von Magenkrebs aufzudecken.
Die Studie konzentrierte sich auf die Analyse des vollständigen Transkriptoms von 10 Magenkrebszelllinien, die vier verschiedene GC-Subtypen umfassten. Um dies zu erreichen, verwendeten die Forscher einen zweigleisigen Ansatz, der Iso-seq- und RNA-seq-Technologien einbezog.
Iso-seq-Technologie: Iso-seq, eine hochmoderne Sequenzierungsmethode, wurde verwendet, um vollständige Transkripte zu erfassen. Diese Methode lieferte längere Leselängen im Vergleich zur traditionellen Sequenzierung, was eine genauere Darstellung des gesamten Transkripts ermöglichte. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifizierung neuartiger Transkripte, die von früheren Sequenzierungstechniken möglicherweise übersehen wurden.
RNA-seq-Technologie: Neben Iso-seq wurde RNA-seq eingesetzt, um quantitative Genexpressionsdaten zu erhalten. Diese Technologie lieferte Informationen über die relative Häufigkeit verschiedener Transkripte in den Zelllinien.
Landschaft des Langlese-Transkriptoms in Magenkrebszelllinien. (Huang et al., 2021)
Eine signifikante Anzahl nicht redundanter Voll-Längen-Transkripte wurde identifiziert, wobei über 60 % neu entdeckte Transkripte repräsentieren. Dies unterstreicht die Stärke der Längssequenzierung, um zuvor nicht annotierte Elemente des Transkriptoms zu erfassen. Neuartige Transkripte wurden als subtyp-spezifisch identifiziert, was auf einen potenziellen Zusammenhang zwischen diesen Transkripten und den unterschiedlichen Subtypen von Magenkrebs hindeutet. Darüber hinaus schien es eine subtypabhängige Präferenz für alternatives Splicing zu geben. Die neu entdeckten Transkripte wiesen im Vergleich zu zuvor bekannten Transkripten komplexere strukturelle Merkmale auf, was auf die Existenz komplizierter regulatorischer Mechanismen hinweist, die an diesen Subtypen von Magenkrebs beteiligt sind. Alternative Promotoren wurden in etwa 25 % der analysierten Gene identifiziert. Wichtig ist, dass viele dieser alternativen Promotoren mit funktionalen Veränderungen in den von ihnen kodierten Proteinen assoziiert waren, was potenziell Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf haben könnte. Der umfassende Datensatz, der durch diese Studie generiert wurde, hat über die unmittelbaren Ergebnisse hinausgehende Implikationen. Es wird erwartet, dass die identifizierten Transkriptvarianten ein verbessertes diagnostisches Potenzial bieten und zu genaueren prognostischen Einschätzungen für verschiedene Subtypen von Magenkrebs beitragen.
Die Ergebnisse der Studie lieferten auch eine wertvolle Ressource an vollständigen Transkriptomdaten, nicht nur für eine weitergehende Erforschung von Magenkrebs, sondern auch für die Untersuchung anderer gastrointestinaler Malignome.
Referenzen:
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Veiga, Diogo FT, et al. "Eine umfassende Plattform zur Analyse von Long-Read-Isoformen und eine Sequenzierungsressource für Brustkrebs." Wissenschaftliche Fortschritte 8.3 (2022): eabg6711.
- Huang, Kie Kyon, et al. "Langzeit-Transkriptom-Sequenzierung zeigt reichhaltige Promotervielfalt in verschiedenen molekularen Subtypen von Magenkrebs." Genombiologie 22 (2021): 1-24.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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