Nutzung von RNA-Sequenzierung zur Analyse von Wirt-Mikroben-Interaktionen

Im komplexen Zusammenspiel zwischen Wirtszellen und kommensalen/pathogenen Bakterien spielt das zelluläre Milieu eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des letztendlichen Ergebnisses dieser Interaktionen. Dazu gehört die Aktivierung oder Unterdrückung bakterieller Virulenzprogramme sowie die Einbindung von Wirtsabwehrmechanismen oder Toleranzreaktionen. Um ein umfassendes Verständnis der grundlegenden Prinzipien, die den Wirts-Mikroben-Interaktionen in gesunden und kranken Zuständen zugrunde liegen, zu erlangen, benötigen wir hochauflösende Methoden, die in der Lage sind, ihre komplexen Dynamiken über verschiedene Skalen hinweg zu erfassen. Dies umfasst Untersuchungen, die vom breiteren Kontext des gesamten Organismus bis hin zu den nuancierten Feinheiten der Einzelzellinteraktionen reichen, die alle dazu beitragen, eine robuste theoretische Grundlage für das Management mikrobenassoziierter Krankheiten zu schaffen.

Drei evolutionäre Phasen der Transkriptomik in Studien zur Wirts-Mikroben-Interaktion

Im Bereich der Infektionsbiologie setzen Forscher verschiedene Ebenen von Assays ein, um die Interaktionen zwischen Wirt und Mikroben zu untersuchen, wie zum Beispiel Genomik, Epigenomik, Transkriptomik, Proteomik, Metabolomik und mehr. Unter diesen, Transkriptomik hat erheblich an Bedeutung gewonnen, da es in der Lage ist, einen Überblick über die Zellphysiologie zu bieten, dank seiner Empfindlichkeit, Kosteneffizienz und breiten Anwendbarkeit. Seit der Einführung von Transkriptom-Sequenzierung Im Bereich der Infektionsbiologie haben wir vor etwa einem Jahrzehnt das Auftreten von drei unterschiedlichen Phasen in der Analyse der Wirts-Mikroben-Interaktionen beobachtet.

In der Anfangsphase (Einseitige RNA-Sequenzierung/Eine-Seitige Studie) sind Wirtszellen und Mikroben physisch getrennt, wobei der Schwerpunkt entweder auf der Untersuchung des Wirts oder des Mikrobens liegt.

Die zweite Phase markiert einen entscheidenden Wandel, in dem beide Seiten der Interaktion gleichzeitig untersucht werden. Diese Phase umfasst das Profiling der Interaktionen zwischen Wirt und Mikrobe (Dual-RNA-Seq oder duales Expressionsprofiling) und vertieft sich in Metatranskriptomik um die breitere Mikrobiomlandschaft zu erkunden. Gleichzeitig gab es eine Neubewertung der Rolle von nicht-kodierenden Transkripten, die zuvor als bloße Nebenprodukte der RNA-seq-Analyse betrachtet wurden. Diese nicht-kodierenden Transkripte haben sich als unschätzbar wertvoll erwiesen, um entscheidende Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Mikroben zu gewinnen.

In der dritten und aktuellen Phase erleben wir den Aufstieg der Einzelzell-Bakterien-Transkriptom-Sequenzierung, einer Technik, die zunehmend eingesetzt wird, um die Heterogenität, die in den Wirts-Mikroben-Interaktionen inhärent ist, zu entschlüsseln. Diese Phase stellt einen bedeutenden Fortschritt in unserer Fähigkeit dar, die komplexen Dynamiken auf Einzelzellebene innerhalb des mikrobiellen Anteils dieser Interaktionen zu untersuchen.

Die Geschichte der RNA-seq-basierten Infektionsforschung. (Westermann et al., 2021)

Erkennungsmethoden für Wirt-Mikrobe-Interaktionen

• Untersuchen Sie die Struktur und Funktion mikrobieller Gemeinschaften durch Metatranskriptom-Sequenzierung.
• Einstellen dual RNA-Sequenzierung um sowohl den Erreger als auch das infizierte Wirtsgewebe zu analysieren.
• Durchführung triple RNA-Seq um virale und bakterielle Co-Infektionen oder konkurrierende Symbionten mit ihren Wirten zu untersuchen.
• Nutzen Sie die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung für die Wirtsanalyse oder die Sequenzierung des einzelnen bakteriellen Transkriptoms.

Grafische Übersicht über RNA-seq-basierte Ansätze zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Arten im Säugetierdarm. (Westermann et al., 2021)

Metatranskriptom-Sequenzierung

Metatranskriptom-Sequenzierung wird eingesetzt, um die Komplexität der Struktur und Funktionalität mikrobieller Gemeinschaften zu erforschen. Eine präzise Quantifizierung der Genexpression im Mikrobiom erfordert einen sorgfältigen Prozess. Um es zu vereinfachen, metagenomische und Metatranskriptomik Daten aus derselben Probe werden zunächst unabhängig verarbeitet. Anschließend, Metagenomik Daten werden verwendet, um metatranskriptomische Daten zu normalisieren, was MT/MG-Werte ergibt, die Änderungen in Gen-, Arten- und funktioneller Aktivität zusammenfassen.

Bemerkenswerterweise haben Studien zum Mikrobiom des Darms eine größere Variabilität in der Metatranskriptom im Vergleich zum Metagenom. Diese Beobachtung impliziert, dass Mikroben eine aktive Regulierung als Reaktion auf Veränderungen in ihrer Umgebung und den Nahrungsbedingungen zeigen. Die Veränderungen in der Zusammensetzung und Funktionalität der menschlichen Darmmikroben wurden mit Krankheitsinfektionen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel wurde die Häufigkeit von mRNAs der Darmmikroben, die Proteine kodieren, die an der antioxidativen Abwehr und der Homöostase von Metallionen beteiligt sind, als negativer Korrelat mit dem Risiko identifiziert, Symptome von Typhusfieber nach einer Infektion zu erleben mit Salmonella typhimurium.

Dual-RNA-Sequenzierung

Dual-RNA-Seq, ein innovativer Ansatz, wird in der Untersuchung von Interaktionen zwischen Krankheitserregern und Säugetierwirten auf transkriptomischer Ebene eingesetzt. Diese hochmoderne Technik ermöglicht die gleichzeitige Analyse der Genexpression innerhalb bakterieller Organismen und infizierter Wirtszellen oder -gewebe, sowohl intrazellulär als auch extrazellulär. Durch dual RNA-SequenzierungWir streben an, bisher unentdeckte Feinheiten in den Wechselwirkungen zwischen Wirtsorganismen und Mikroben zu enthüllen, was ein tieferes Verständnis dieser Abhängigkeiten verspricht.

Die grundlegenden Schritte in gängigen Protokollen für strand-spezifisches Profiling von Bakterien, Säugetieren oder dualem Ausdruck. (Westermann et al., 2021)

Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung (scRNA-seq)

In den letzten Jahren hat der Fortschritt der Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung (scRNA-seq) Technologie eine neue Ära der Transkriptomik eingeläutet, die zu zahlreichen bedeutenden Entdeckungen geführt hat. Diese Entdeckungen reichen von der Identifizierung zuvor unbekannter Zelltypen und physiologischer Zustände bis hin zur Entschlüsselung neuartiger genregulatorischer Wege. Forscher haben begonnen, die entscheidende Rolle der zellulären Heterogenität in den Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen zu erkennen. Zum Beispiel nutzen Pathogene die bereits vorhandene und induzierte zelluläre Heterogenität, um infektiöse ökologische Nischen zu etablieren.

Innerhalb der Pathogenpopulation selbst gibt es eine erhebliche phänotypische Vielfalt. Zum Beispiel, Salmonella typhimurium zeigt einen bistabilen Ausdruck invasiver Gene, selbst bevor sie auf Wirtszellen treffen, und diese Genexpressionsvielfalt intensiviert sich im Verlauf der Infektion. Diese Strategie bietet einen einzigartigen Vorteil - die Invasion bestimmter Subpopulationen von Salmonellen induziert eine Epithelentzündung, die wiederum die weitere Invasion anderer erleichtert Salmonella typhimurium Stämme im intestinalen Lumen.

Um tiefere Einblicke in diese komplexen Dynamiken zu gewinnen, sind hochauflösende transkriptomische Ansätze unerlässlich. Diese fortschrittlichen Methoden ermöglichen es uns, zu erfassen und zu analysieren, wie zelluläre Heterogenität die Ergebnisse von Wirt-Mikroben-Interaktionen beeinflusst.

Referenz:

1. Westermann, Alexander J., und Jörg Vogel. "Cross-Species RNA-Seq zur Entschlüsselung von Wirt-Mikrobe-Interaktionen." Nature Reviews Genetics 22.6 (2021): 361-378.