Übersicht über die cDNA-Synthese

Was ist die cDNA-Synthese?

Die cDNA-Synthese, die durch den Prozess der reversen Transkription erreicht wird, beinhaltet die Transkription von RNA in DNA und stellt somit eine wesentliche Ergänzung und Modifikation des zentralen Dogmas der Molekularbiologie dar. In experimentellen Kontexten treten typischerweise zwei unterschiedliche Ausdrucksmodi auf: die reverse Transkription und die Retrotranskription. Erstere umfasst die gezielte Extraktion von RNA zum Zweck der Synthese von DNA, während letztere den autonomen Prozess bezeichnet, durch den RNA-Viren RNA in DNA transkribieren. Bemerkenswerterweise erfolgt erstere ex vivo, während letztere in vivo stattfindet.

Die Synthese von cDNA umfasst sowohl die Synthese des ersten Strangs als auch die des zweiten Strangs. Im Allgemeinen beinhalten Methoden zur Synthese des ersten Strangs von cDNA die Verwendung von totaler RNA oder gereinigtem mRNA als Vorlagen, wobei die Synthese mit RNA-abhängiger DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) katalysiert wird, häufig unter Verwendung von Oligo (dT) Primern oder zufälligen Primern. Anschließend kann die Synthese des zweiten Strangs durchgeführt werden, um vollständige doppelsträngige cDNA zu erhalten.

Eine detaillierte Erläuterung der Methoden, Einflussfaktoren, experimentellen Verfahren, Vorsichtsmaßnahmen und Anwendungen der cDNA-Synthese innerhalb eines wissenschaftlichen Artikels hat von größter Bedeutung. Eine solche Erläuterung unterstützt die Leser dabei, die Prinzipien und Methoden, die dieser Technik zugrunde liegen, sowie ihre praktische Nützlichkeit in verschiedenen Forschungsbereichen umfassend zu verstehen.

Ein Überblick über das Verfahren zur cDNA-Synthese aus Zelllysaten. (Judith E Meis et al.) Naturmethoden 2009)

Methoden der cDNA-Synthese

Faktoren, die die cDNA-Synthese beeinflussen

Der Prozess der reversen Transkription, obwohl scheinbar unkompliziert, unterliegt verschiedenen Einflussfaktoren, einschließlich der Qualität der Vorlage, des Primerdesigns, der Enzymaktivität und der Reaktionsbedingungen.

Vorlage

RNA Sekundärstruktur (Hoher GC-Gehalt, Komplexe Faltung)

RNA-Moleküle falten sich aufgrund ihrer Sequenzzusammensetzung in komplexe sekundäre Strukturen und weisen verschiedene Motive wie Helices, Schleifen, Bulges, interne Schleifen und Mehrfachverzweigungen auf. Die Stabilität dieser Strukturen variiert je nach Basenpaarung; beispielsweise sind GC-Basenpaare stabiler aufgrund der Anwesenheit von drei Wasserstoffbrücken, während AU-Basenpaare zwei Wasserstoffbrücken beinhalten und GU-Paare die am wenigsten stabilen sind, mit nur einer Wasserstoffbrücke. Folglich neigen RNA-Vorlagen mit höherem GC-Gehalt dazu, komplexere sekundäre Strukturen zu zeigen, was die Verlängerung von Primern während der reversen Transkription behindern und die Länge der synthetisierten cDNA beeinflussen kann. Um dem entgegenzuwirken, kann die Denaturierung der sekundären Strukturen erreicht werden, indem die Vorlage 5 Minuten lang bei 65 °C inkubiert und anschließend schnell auf Eis abgekühlt wird. Darüber hinaus kann die Durchführung der Reaktion bei erhöhten Temperaturen (z. B. 55 °C) die Bildung von RNA-sekundären Strukturen reduzieren.

Reinheits- und Konzentrationsbestimmung

Die Reinheit von RNA beeinflusst die reversen Transkription erheblich, da Verunreinigungen, die während der RNA-Reinigung eingeführt werden, wie Salze, Metallionen, Ethanol und Phenol, häufig als Hemmstoffe der reversen Transkriptase wirken. Die Nanodrop-Spektrophotometrie wird typischerweise verwendet, um die RNA-Reinheit zu bewerten, wobei optimale Werte im Bereich von 1,8 < OD260/OD280 < 2,0 liegen (Werte unter 1,8 deuten auf Protein- oder Phenolverunreinigungen hin, die durch Phenolextraktion behoben werden können; Werte über 2,0 können auf verbleibendes Guanidinthiocyanat hindeuten). Darüber hinaus sollte das Verhältnis OD260/OD230 2 überschreiten (Werte unter 2 deuten auf das Vorhandensein von Guanidinthiocyanat, β-Mercaptoethanol oder Ethanolrückständen hin, was wiederholte Ethanolpräzipitation und -wäsche erforderlich macht).

Integrität

Die Integrität von RNA hat einen erheblichen Einfluss auf die Länge und Qualität des synthetisierten cDNA. Besondere Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und Masken sowie die Verwendung von RNA-freien Verbrauchsmaterialien während der RNA-Extraktion, Handhabung und Lagerung, sind entscheidend für die Erhaltung der RNA-Integrität. Die RNA-Integrität beeinflusst direkt die Länge der synthetisierten cDNA und damit die nachfolgenden Klonierungsexperimente und die Genauigkeit quantitativer Genexpressionsanalysen.

Entfernung von genomischer DNA (gDNA)

Das Vorhandensein von gDNA in totalem RNA kann zu falsch-positiven Ergebnissen in nachgelagerten qPCR-Experimenten führen, da gDNA als Vorlage für die PCR-Amplifikation dienen kann. Daher ist es vor der reversen Transkription unerlässlich, gDNA aus der RNA-Vorlage zu entfernen, um sicherzustellen, dass nur cDNA synthetisiert wird. Die Behandlung mit DNase I wird häufig zur Entfernung von gDNA eingesetzt; es ist jedoch wichtig, DNase I vor der reversen Transkription zu inaktivieren, um ihre Abbauaktivität auf cDNA zu verhindern. Während die Hitzedeaktivierung von DNase I RNA abbauen kann und die Zugabe von EDTA als Inaktivator neue RNAse-Hemmer einführt, ist eine sorgfältige Optimierung erforderlich, um die RNA-Integrität zu wahren und gleichzeitig eine vollständige Entfernung von gDNA sicherzustellen.

Primer-Auswahl bei der cDNA-Synthese

Oligo(dT)-Primer

Oligo(dT)-Primer bestehen aus ungefähr 12-18 wiederholten Oligothymidin-Nukleotiden, die speziell dafür entwickelt wurden, an den Poly(A)-Schwanz von eukaryotischer mRNA zu binden. Daher sind sie ungeeignet für RNA, die keine Poly(A)-Schwanzstruktur aufweist, wie prokaryotische RNA oder MikroRNA, und werden nicht für die Verwendung mit degradierten RNA-Proben, wie denen aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Geweben, empfohlen.

Eukaryotische mRNA macht typischerweise nur 1%-5% der gesamten RNA aus. Daher werden Oligo(dT)-Primer bevorzugt ausgewählt, um cDNA-Bibliotheken aus eukaryotischen Quellen zu erstellen oder um vollständige cDNA zu klonen und 3' RACE-Experimente durchzuführen. Bei komplexen RNA-Vorlagen mit umfangreichen Sekundärstrukturen kann die Primerverlängerung jedoch vorzeitig enden, wenn sie auf diese Strukturen trifft, was möglicherweise zu einem Informationsverlust vom 5'-Ende der mRNA bei Verwendung von Oligo(dT)-Primern führen kann.

Zufällige N6-N9 Primer

Zufällige Primer bestehen aus kurzen Oligonukleotiden, die aus zufälligen Nukleotidsequenzen bestehen und typischerweise aus 6 Nukleotiden bestehen, die als zufällige Hexamere bekannt sind. Diese Primer haben keine Spezifität und können an verschiedene RNA-Arten annealen, einschließlich rRNA, tRNA, nicht-kodierender RNA, kleiner RNA, degradierter RNA und RNAs mit komplexen Sekundärstrukturen. Während zufällige Primer die Ausbeute und Konzentration von cDNA erhöhen können, können sie zu kürzeren cDNA-Syntheseprodukten führen.

Gen-spezifische Primer

Gen-spezifische Primer (GSPs) sind so konzipiert, dass sie spezifisch mit der Ziel-mRNA-Sequenz komplementär sind, was zu einer hochgradig gezielten cDNA-Synthese führt, die besonders geeignet ist für die anschließende PCR-Amplifikation bekannter Zielsequenzen. Diese Primer werden häufig in Ein-Schritt-RT-PCR-Reaktionen eingesetzt. In Fällen, in denen GSPs nicht effizient die erste cDNA-Strang synthetisieren, können Oligo(dT) oder zufällige Primer als Alternativen dienen.

Enzyme in der cDNA-Synthese

Verschiedene Reverse-Transkriptasen zeigen unterschiedliche funktionale Aktivitäten und weisen unterschiedliche Effizienzen bei der cDNA-Synthese auf, einschließlich Länge, Ausbeute und Anpassungsfähigkeit an komplexe Vorlagen.

RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität: Katalysiert die Synthese von DNA aus dNTPs unter Verwendung von RNA als Vorlage.

RNaseH-AktivitätSpaltet RNA innerhalb von RNA-DNA-Hybridmolekülen während der Reaktion. Die Reduzierung dieser Aktivität verhindert den Abbau der RNA-Vorlage, bevor längere cDNA-Moleküle synthetisiert werden.

DNA-abhängige DNA-Polymerase-AktivitätVerwendet den ersten synthetisierten cDNA-Einzelstrang als Vorlage, um den zweiten cDNA-Strang zu erzeugen.

Thermische StabilitätDiese Eigenschaft ist entscheidend für die cDNA-Synthese. Die Erhöhung der Temperatur während der reversen Transkription hilft, hoch-GC-reiche oder strukturell komplexe RNA-Vorlagen zu denaturieren, was die Synthese von voll-längiger cDNA erleichtert.

TreueBezieht sich auf die Genauigkeit der Sequenzreplikation während der reversen Transkription von RNA in cDNA. Da Reverse-Transkriptasen keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität und keine Fehlerkorrekturmechanismen aufweisen, ist die Fehlerquote in der synthetisierten cDNA relativ hoch. Im Allgemeinen sind Fehler, die während der reversen Transkription eingeführt werden, vernachlässigbar, es sei denn, es sind hohe Sequenzgenauigkeiten erforderlich, da sie in den nachfolgenden Schritten nicht amplifiziert werden.

InhibitorresistenzRobuste Reverse-Transkriptasen sind entscheidend für eine erfolgreiche cDNA-Synthese, wenn die Vorlagen eine geringe Reinheit aufweisen oder Inhibitoren enthalten.

Reaktionsprozess

Die optimale Temperatur für die reversen Transkription liegt typischerweise bei 42°C. In Fällen mit Vorlagen mit hohem GC-Gehalt oder Komplexität kann es jedoch vorteilhaft sein, die Temperatur der reversen Transkription auf 50°C zu erhöhen. Die resultierenden Produkte der reversen Transkription können umgehend in qPCR-Reaktionen verwendet oder kurzfristig bei -20°C gelagert werden. Für eine längere Aufbewahrung wird empfohlen, sie zu aliquotieren und bei -80°C zu lagern, um schädliche Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.

Im Wesentlichen hängt das Erreichen einer effizienten reversen Transkriptionsreaktion von mehreren Faktoren ab: der Qualität der RNA-Vorlagen, der Eignung der reversen Transkriptase-Enzyme, der Auswahl geeigneter Primer und der Festlegung optimaler Reaktionsbedingungen. Es ist unerlässlich, all diese Einflussfaktoren während des gesamten experimentellen Prozesses sorgfältig zu berücksichtigen, um hochfidel cDNA zu synthetisieren, die für nachfolgende Anwendungen geeignet ist.

cDNA-Syntheseprinzip

Die cDNA-Synthese umfasst die Umwandlung von mRNA in cDNA durch eine Reihe orchestrierter biochemischer Schritte:

mRNA-ExtraktionGesamt-RNA, die mRNA-Moleküle enthält, wird sorgfältig aus zellulären Quellen extrahiert.

Reverse TranskriptionsreaktionDie extrahierte mRNA dient als Vorlage und reagiert mit dem Enzym der reversen Transkriptase (typischerweise reversen Transkriptase), wodurch die Bildung von einzelsträngiger cDNA katalysiert wird.

Reverse-Transkriptase-Synthese von cDNADurch die Nutzung des Poly(A)-Schwanzbereichs der mRNA-Vorlage mit Poly(T)-Primern, in Verbindung mit der reversen Transkriptase und deren reverser Transkriptionsaktivität, wird einzelsträngige cDNA sorgfältig synthetisiert.

DNA-SyntheseDNA-Polymerase (wie DNA-Polymerase I) wird für die Synthese des komplementären Strangs genutzt, was zur Bildung von doppelsträngigem cDNA führt. Dieser Prozess erfordert das Puffer von DNA-Polymerase I, drei dNTPs und Oligonukleotid-Primer.

Enzymatische SpaltungDas resultierende doppelsträngige cDNA wird einer präzisen enzymatischen Spaltung unterzogen, bei der spezifische Enzyme eingesetzt werden, um RNA-Vorlagen oder andere Nicht-cDNA-Sequenzen zu entfernen.

LigaturAdaptermoleküle werden strategisch an die Enden des cDNA ligiert, um nachfolgende Amplifikations- und Klonierungsbemühungen zu erleichtern.

Im Wesentlichen umfasst die cDNA-Synthese die Reverse Transkription von mRNA in einzelsträngige cDNA, gefolgt von der DNA-Polymerase-vermittelten Synthese komplementärer Stränge, enzymatischer Spaltung und ligasevermittelter Verkettung, was in der Produktion von cDNA gipfelt.

cDNA-Syntheseprotokoll

cDNA-Erststrang-Synthese:

1. In einem sterilen, RNA-freien 0,2 mL Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren Sie die folgende Reaktionsmischung:

Template-RNA: Gesamt-RNA 1-5 μg oder poly(A+) mRNA 0,1-0,5 μg

Primer: Oligo(dT)18 (0,5 μg/μL) 1 μL, oder zufällige Hexamer-Primer (0,2 μg/μL) 1 μL, oder sequenzspezifische Primer 20 pmol.

RNase-freies ddH2O: Auf ein Endvolumen von 17 μL bringen.

2. Sanft mischen und 3-5 Sekunden zentrifugieren.

3. Erhitze das Reaktionsgemisch in einem Wasserbad bei 70 °C für 5 Minuten, gefolgt von einer Inkubation auf Eis für 30 Sekunden, und zentrifugiere dann für 3-5 Sekunden.

4. Halten Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie die folgenden Komponenten hinzu:

cDNA-First-Strand-Puffer (5×): 4 μL

RNase-Inhibitor (20 U/μL): 1 μL

dNTP-Mix (10 mmol/L): 2 μL

5. Sanft mischen und 3-5 Sekunden zentrifugieren.

6. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch 5 Minuten lang bei 37 °C, fügen Sie dann 1 μL M-MLV-Reverse-Transkriptase (20 U/μL) hinzu, um ein Endvolumen von 25 μL zu erreichen. Übertragen Sie 5 μL in ein anderes Röhrchen und fügen Sie 2-5 μCi [α-32P] dCTP (>400 Ci/mmol) für die Messung der Radioaktivität der Incorporation des ersten Strangs hinzu.

7. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 60 Minuten (wenn Sie Random Hexamer-Primer verwenden, inkubieren Sie zuerst bei 25 °C für 10 Minuten und fahren dann bei 37 °C für 60 Minuten fort).

8. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 70 °C erhitzen, und kühlen Sie sie dann auf Eis für die anschließende cDNA-Zweitstrang-Synthese oder lagern Sie sie gefroren.

9. Stoppen Sie die Reaktion in den für die Incorporationsmessung vorgesehenen Röhrchen, indem Sie 95 μL einer 50 mmol/L EDTA-Lösung hinzufügen, wodurch das Gesamtvolumen auf 100 μL gebracht wird. Nehmen Sie 90 μL für die Gel-Elektrophorese-Analyse (vorhergehende Phenolextraktion) und reservieren Sie 10 μL für die Messung der Isotopen-Inkorporationsradioaktivität.

cDNA-Zweite-Strang-Synthese:

1. Die Synthese des zweiten Strangs kann direkt im Reaktionsgemisch der ersten Strang-Synthese durchgeführt werden. Nehmen Sie 20 μL des Reaktionsgemisches der ersten Strang-Synthese und fügen Sie nacheinander hinzu:

• 10× Zweitstrangpuffer: 10 μL
• DNA-Polymerase I: 23 U
• RNase H: 0,8 U
• RNase-freies ddH2O auf ein Endvolumen von 100 μL.

2. Sanft mischen. Wenn isotopische Markierung zur Messung der Radioaktivität des zweiten Strangs gewünscht ist, übertragen Sie 10 μL in ein anderes Röhrchen und fügen Sie 2-5 μCi [α-32P] dCTP hinzu.

3. Inkubieren Sie bei 14 °C für 2 Stunden (verlängern Sie auf 3-4 Stunden für die Synthese von cDNA länger als 3 kb).

4. Für die Incorporationsmessung 90 μL einer 50 mmol/L EDTA-Lösung in das vorgesehene Röhrchen geben, 10 μL für die Messung der radioaktiven Isotopenmarkierung reservieren und den Rest für die Gel-Elektrophorese-Analyse verwenden.

5. Erhitze das Reaktionsgemisch aus dem cDNA-Zweite-Strang-Syntheserohr bei 70 °C für 10 Minuten und kühle es anschließend nach einer Niedriggeschwindigkeitszentrifugation auf Eis.

6. Fügen Sie 2 U T4-DNA-Polymerase hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 Minuten.

7. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 10 μL einer 200 mmol/L EDTA-Lösung hinzufügen.

8. Führen Sie eine Phenol/Chloroform-Extraktion der cDNA-Reaktionsmischung durch, gefolgt von einer Zentrifugation bei 12.000 U/min für 5 Minuten.

Übertragen Sie die wässrige Phase in ein anderes Röhrchen, fügen Sie 1/10 Volumen 3 mol/L NaAc (pH 5,2) hinzu, mischen Sie, und fügen Sie dann das 2,5-fache Volumen kalten Ethanols (-20°C) hinzu und inkubieren Sie bei -20°C für 1 Stunde.

Zentrifugieren Sie bei 4 °C, 12.000 U/min für 15 Minuten, entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 70 % Ethanol.

Zentrifugieren bei 4°C, 12.000 U/min für 5 Minuten, Überstand abwerfen und bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.

12. Lösen Sie das Pellet in 10-20 μL TE-Puffer auf.

Quantifizierung des cDNA-Syntheseprodukts:

1. Nehmen Sie 3 μL jeder Reaktionsmischung, die Isotope enthält, und träufeln Sie sie auf Glasfaserfilterpapier. Lassen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen; diese Proben repräsentieren die gesamte radioaktive Aktivität.

2. Nehmen Sie ebenfalls 3 μL jeder Reaktionsmischung und mischen Sie sie mit 100 μL Lachs-Spermien-DNA (1 mg/mL). Nach gründlichem Mischen fügen Sie 0,5 mL 5% TCA hinzu und vortexen Sie. Inkubieren Sie die Mischung 5-30 Minuten auf Eis.

3. Filtern Sie das Reaktionsgemisch durch Glasfaserfilterpapier, waschen Sie es dreimal mit kaltem 5% TCA (jeweils mit 5 mL TCA), gefolgt von einer Spülung mit 5 mL wasserfreiem Ethanol. Diese Proben repräsentieren die angereicherte radioaktive Aktivität.

4. Messen Sie die Intensitäten sowohl der gesamten radioaktiven Aktivität als auch der markierten radioaktiven Aktivität mit einem Geigerzähler oder einem Flüssigszintillationszähler.

5. Quantifizierung des Produkts der ersten cDNA-Strang-Synthese:

• Erste-Strang-Spike-in-Rate (%) = [hinzugefügte radioaktive Aktivität (cpm) / gesamte radioaktive Aktivität (cpm)] × 100%
• Spiked dNTPs (nmol) = 2 nmol dNTP/μL × Reaktionsvolumen (μL) × (Spike-in-Rate der ersten Strang)
• Synthesierte cDNA-Menge (ng) = zugesetzte dNTP (nmol) × 330 ng/nmol
• mRNA zu cDNA Umwandlungsrate = [synthetisierte cDNA-Menge (ng) / Template-RNA-Menge (ng)] × 100%

Zum Beispiel, wenn die gesamte radioaktive Aktivitätsintensität 254.000 cpm beträgt, die angereicherte radioaktive Aktivitätsintensität 3.040 cpm beträgt und 1 μg RNA-Vorlage mit einem Reaktionsvolumen von 25 μL verwendet wird, dann:

• Spike-in-Rate = (3.040/254.000) × 100% = 1,2%
• Spiked dNTP-Menge = 2 nmol dNTP/μL × 25 × 1,2% = 0,6 nmol
• Synthesierte cDNA-Menge = 0,6 nmol dNTP × 330 ng/nmol = 198 ng
• mRNA zu cDNA Umwandlungsrate = (198 ng / 1000 ng) × 100% = 19,8%

Unter Berücksichtigung, dass 20 % (5 μL/25 μL) von 1000 ng RNA für das Spike verwendet werden, und das Reaktionsvolumen 80 % des Gesamtvolumens ausmacht, beträgt die tatsächliche Menge an cDNA-Synthese des ersten Strangs 0,8 × 198 ng = 158 ng.

6. Quantifizierung des Syntheseprodukts der zweiten cDNA-Strang:

• Abgesehen von der Entfernung der spiked dNTPs der ersten Strang, ähnelt die Methode der Berechnung des Ertrags des ersten Strangs.

Zweite-Strang Spike-in-Rate = [gespikte radioaktive Aktivität (cpm) / gesamte radioaktive Aktivität (cpm)] × 100% Gespikte dNTP-Menge (nmol) = [(0,4 nmol/μL × Reaktionsvolumen (μL)) - erste-Strang Spike-in nmol] × zweite-Strang Spike-in-Rate Zweite-Strang cDNA-Synthesemenge (ng) = nmol dNTP × 330 ng/nmol Doppelstrang cDNA-Umwandlungsrate = [zweite-Strang cDNA-Synthesemenge (ng) / erste-Strang cDNA-Synthesemenge (ng)] × 100%

Zum Beispiel, wenn die radioaktive Aktivitätsintensität des zweiten Strangs 2.780 cpm beträgt und die gesamte radioaktive Aktivitätsintensität 235.000 cpm beträgt:

• Die Spike-in-Rate des zweiten Strangs = (2.780/235.000) × 100% = 1,18%
• Die Menge an angereicherten dNTPs = [(0,4 nmol/μL × 100 μL) - 0,48 nmol] × 1,18% = 0,47 nmol
• Synthesierte Menge der zweiten cDNA-Strang (ng) = 0,47 nmol × 330 ng/nmol = 155 ng
• Die Umwandlungsrate von doppelsträngigem cDNA = (155 ng / 158 ng) × 100% = 98%

Im Allgemeinen wird eine Umwandlungsrate der ersten Strang von 12%-50% und eine Umwandlungsrate des doppelsträngigen DNA von 50%-200% als optimal angesehen.

cDNA-Syntheseprodukt-Elektrophorese-Analyse

Isotopisch markierte cDNA-Produkte können mit alkalischer Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Sowohl die synthetisierten Produkte als auch die DNA-Molekulargewichtsstandards sollten mit 32P markiert sein. Das DNA-5'-Ende-Markierungskit kann zum Markieren verwendet werden.

Bereiten Sie ein 1,4% alkalisches Agarosegel in alkalischem Gel-Elektrophoresepuffer vor und lassen Sie es mindestens 30 Minuten im alkalischen Elektrophoresepuffer ausgleichen.

2. Passen Sie das Volumen der Probenlösung mit TE-Puffer an, um das Volumen der Lösungen zur Bestimmung des Ertrags der ersten und zweiten Strang zu entsprechen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Ladepuffer hinzu (2x Ladepuffer sollte bei -20 °C gelagert oder vor jedem Gebrauch hinzugefügt werden).

3. Laden Sie die Proben auf das Gel, wobei Sie sicherstellen, dass die Farbmigration etwa 1/3 der Gellänge von der Vorderkante entfernt ist. Wenden Sie ein elektrisches Feld mit einer Spannung von 5 V/cm an.

4. Stoppen Sie die Elektrophorese und tauchen Sie das Gel 30 Minuten lang (oder bis der Farbstoff von Blau zu Gelb wechselt) in 7% TCA bei Raumtemperatur ein. Entfernen Sie das Gel und legen Sie es auf Filterpapier, dann lassen Sie es mehrere Stunden an der Luft trocknen.

5.Wickeln Sie das getrocknete Gel in Frischhaltefolie und setzen Sie es bei Raumtemperatur (oder bei -70 °C, wenn Sie einen Intensivbildschirm verwenden) Röntgenfilm aus.

Überlegungen zur cDNA-Synthese

Auswahl der geeigneten reversen TranskriptaseVerschiedene Reverse-Transkriptasen weisen unterschiedliche Eigenschaften und Eignungskriterien auf. Zum Beispiel kann für den Aufbau von Bibliotheken und das Klonen unbekannter Sequenzen eine Reverse-Transkriptase mit terminaler Transferaseaktivität und der Fähigkeit zum Template-Switching, wie die MMLV RTase, erforderlich sein. Im Gegensatz dazu könnte für kürzere Transkripte, wie sie in der qPCR-cDNA-Vorbereitung verwendet werden, die AMV RTase geeigneter sein.

Eliminierung von genomischer DNA-KontaminationVor der reversen Transkription RNA-Proben mit DNaseI behandeln, um Kontaminationen durch genomische DNA zu entfernen. Stellen Sie die vollständige Inaktivierung von DNaseI sicher, um eine Zersetzung von cDNA in den nachfolgenden Schritten zu verhindern.

Auswahl geeigneter PrimerWählen Sie Primer basierend auf den experimentellen Zielen aus. Zum Beispiel werden Oligo-dT-Primer typischerweise für eukaryotische mRNA verwendet, während zufällige Primer für prokaryotische RNA oder RNA ohne Polyadenylierung verwendet werden sollten.

Sicherstellen der Qualität der RNA-VorlageHochwertige RNA-Vorlagen sind entscheidend für die Synthese von vollwertigem cDNA. Führen Sie eine Gelelektrophorese durch, um die Integrität der RNA zu beurteilen und die Reinheit sicherzustellen, und vermeiden Sie wiederholte Gefrier- Auftauvorgänge.

Kontrolle der ReaktionsbedingungenDie geeignete Temperatur und Zeit für die reversen Transkription sind entscheidend für die Effizienz und Qualität der cDNA-Synthese. Bei RNA-Vorlagen mit komplexen Sekundärstrukturen oder hohem GC-Gehalt kann es notwendig sein, die Temperatur der reversen Transkription zu erhöhen oder spezialisierte reverse Transkriptasen zu verwenden.

Lagerung von cDNAReverse-Transkriptionsprodukte können kurzfristig bei -20 °C gelagert werden, aber für die Langzeitlagerung wird empfohlen, sie zu aliquotieren und bei -80 °C zu lagern.

Zusätzlich können für spezifische experimentelle Anforderungen wie GeneRacer-Assays neue Techniken erforderlich sein, die Dephosphorylierung, Decapping, RNA-Adapter-Ligation gefolgt von reverser Transkription umfassen, wobei mRNA mit Cap- und Poly-A-Strukturen benötigt wird. Bei der cDNA-Synthese sollte auch darauf geachtet werden, RNA-Template-Abbau und fehlerhafte Einführung von cDNA zu vermeiden, während die cDNA-Fidelität und die Widerstandsfähigkeit gegen Hemmungen erhöht werden.

cDNA-Synthese-Anwendungen

Der Prozess der cDNA-Synthese hat eine Vielzahl von Anwendungen in Laborabläufen, wie zum Beispiel SequenzierungqRT-PCR GenexpressionstudiencDNA-Bibliotheksvorbereitung, Genklonierung und Studien zur Genentdeckung.

cDNA-Synthese für RNA-Sequenzierung

cDNA-Synthese, ein kritischer Bestandteil von genetische Ausdrucksanalyse und Transkriptomforschungspielt eine grundlegende Rolle bei der Umwandlung von RNA-Molekülen in cDNA. Die Befolgung der beschriebenen Verfahren und Anwendungsempfehlungen ermöglicht es Forschern, hochqualitative cDNA zu erhalten, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet ist, wie zum Beispiel RNA-Sequenzierung.

Bei CD Genomics bieten wir hochwertige RNA-Sequenzierung Dienstleistungen zur Unterstützung von Forschern bei der Beschaffung genauer und zuverlässiger Transkriptomdaten. Unsere RNA-Sequenzierungsdienste decken verschiedene Aspekte ab, einschließlich der gesamten Transkriptomsequenzierung, gezielter Sequenzierung, Einzelzellsequenzierung und anderer, und bieten Forschern umfassende Lösungen für transkriptomische Studien.

Umriss der Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (HTR) Bibliotheksvorbereitung. (Ravi Kumar et al.) Grenzen der Pflanzenwissenschaften 2012)

Genentdeckung und Expressionsprofilierung

Die cDNA-Synthese ist ein grundlegender Prozess in der Genentdeckung, der die Erforschung des komplexen Bereichs der Genexpression erleichtert. Durch die Synthese von cDNA aus mRNA-Vorlagen tauchen Forscher in die unterschiedlichen Muster der Genexpression in verschiedenen physiologischen Kontexten ein. Diese Methodik hilft nicht nur dabei, neue Gene zu entdecken, sondern erläutert auch deren Regulationsmechanismen und funktionale Bedeutung innerhalb biologischer Systeme.

Nutzung der cDNA-Mikroarray-Technik

Eine bemerkenswerte Anwendung der cDNA-Synthese betrifft das Gebiet der cDNA-Mikroarray-Technologie. Diese fortschrittliche Methode ermöglicht umfassende Genexpressionsprofilierung und die gleichzeitige Untersuchung von Tausenden von Genen. Durch die Hybridisierung von cDNA-Sonden, die aus verschiedenen experimentellen Bedingungen stammen, auf Mikroarray-Plattformen können Forscher umfassende Einblicke in die molekularen Signaturen gewinnen, die mit verschiedenen Krankheiten und biologischen Phänomenen verbunden sind.

Genklonierung und rekombinante Proteinproduktion

Die Synthese von cDNA hat eine herausragende Bedeutung, die weit über die bloße Entdeckung von Genen hinausgeht. Im Bereich der Genklonierungsinitiativen etabliert sich die cDNA-Synthese als eine zuverlässige und effektiv umsetzbare Methode zur Erzeugung rekombinanter Proteine. Durch die Einfügung von cDNA-Fragmenten in ausgeklügelte Expressionsvektorsysteme sind Forscher in der Lage, die Expression von Proteinen von besonderem Interesse in einer heterologen Wirtsumgebung zu induzieren. Diese Wirtsysteme können so unterschiedlich sein wie gängige Bakterienstämme oder Hefekulturen. Ein solches Vorgehen erleichtert die Kultivierung erheblicher Mengen von makellos reinen Proteinen. Bemerkenswerterweise hat das Ausmaß dieses Prozesses direkte Auswirkungen auf die Durchführung komplexer biochemischer und funktioneller Untersuchungen sowie die Entwicklung therapeutischer Modalitäten.

Nutzung von cDNA-Bibliotheken für die funktionelle Genomik

cDNA-Bibliotheken, die aus klonierten cDNA-Fragmenten bestehen, die die exprimierten Gene innerhalb einer Zelle oder eines Gewebes repräsentieren, dienen als unschätzbare Ressourcen für funktionelle Genomik-Untersuchungen. Durch das Screening von cDNA-Bibliotheken können Forscher Gene identifizieren, die mit spezifischen zellulären Prozessen oder interessierenden Phänotypen verbunden sind. Darüber hinaus erleichtern cDNA-Bibliotheken die funktionale Aufklärung von Genen durch Gain- oder Loss-of-Function-Methoden und bieten Einblicke in ihre Funktionen sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten.

Molekulare Epidemiologie und Pathogencharakterisierung

In der Forschung zu Infektionskrankheiten nimmt die cDNA-Synthese eine zentrale Rolle in der molekularen Epidemiologie und der Charakterisierung von Krankheitserregern ein. Durch die Synthese von cDNA aus viralen RNA-Genomen können Forscher die Verbreitung viraler Krankheitserreger nachverfolgen und deren evolutionäre Dynamik entschlüsseln. Darüber hinaus beschleunigt die cDNA-Synthese die Charakterisierung viraler Genome, was die Erstellung von diagnostischen Tests und gezielten therapeutischen Interventionen erleichtert.

Fortschritte in der schnellen cDNA-Synthese für die Virusgenomik

Jüngste Fortschritte in den Techniken der cDNA-Synthese haben einen Paradigmenwechsel in der Virusgenomik bewirkt, insbesondere im Bereich der doppelsträngigen RNA (dsRNA) Viren. Innovationen wie die Vollständige Amplifikation von cDNAs (FLAC) sind entstanden, die eine schnelle Erzeugung von vollständigen cDNA-Kopien von dsRNA-Genen ermöglichen. Dieser Durchbruch erleichtert die Hochdurchsatz-Sequenzierung und molekulare Epidemiologiestudien und befähigt Forscher, schnell Sequenzdaten aus zahlreichen Virusisolaten zu generieren. Folglich verbessern diese bahnbrechenden Methoden die Überwachung und das Management von Viruskrankheiten.

Häufig gestellte Fragen:

Q: Was ist der Zweck der cDNA-Synthese in der RNA-Sequenzierung?

A: Obwohl es möglich ist, RNA-Moleküle direkt zu sequenzieren, nutzen ein erheblicher Prozentsatz der RNA-Seq-Studien Instrumente, die hauptsächlich für die DNA-Sequenzierung konzipiert sind. Diese Präferenz ist hauptsächlich auf die fortgeschrittene technische Kompetenz der kommerziell erhältlichen DNA-basierten Sequenzierungsinstrumente zurückzuführen. Folglich stellt die Erstellung einer cDNA-Bibliothek aus RNA einen notwendigen Schritt im RNA-Seq-Verfahren dar.

F: Wie viel RNA sollte ich für die cDNA-Synthese verwenden?

Die erforderliche Menge an RNA für eine erfolgreiche cDNA-Synthese hängt von zwei Schlüsselfaktoren ab: der Empfindlichkeit der reversen Transkriptase und der Häufigkeit der Zielsequenz. Die meisten etablierten Protokolle schlagen vor, RNA-Mengen zwischen 0,1 und 1 µg zu verwenden, obwohl in bestimmten Fällen diese Menge zwischen 100 ng und 20 µg variieren kann.

Berücksichtigen Sie auch die Qualität der RNA und die Kopienzahl des interessierenden Transkripts, da sie erheblich zum Ct-Wert beitragen. Ein hervorragendes Beispiel ist, dass eine hochqualitative RNA-Probe von nur 100 ng für ein Gen, das umfangreich transkribiert wird, ausreichen könnte.

Die angemessene Verwendung von RNA zu interpretieren, ist entscheidend, da eine übermäßige Menge zu kontraintuitiven Ergebnissen führen kann. Es ist bemerkenswert, dass die Übergangsrate von RNA zu cDNA in praktischen Szenarien erhebliche Variabilität aufweist, wobei die Effizienz der reversen Transkription (RT) häufig unter 100 % liegt. Die am häufigsten mit suboptimalen RT-Effizienzraten verbundenen Faktoren sind eine minderwertige Primergestaltung, unangemessene Reagenzkonzentrationen oder ungünstige Reaktionsbedingungen.