Richtlinien zur Probenübermittlung für Hochdurchsatz-Sequenzierung

DNA-Proben

DNA-Proben sollten bei -20℃ gelagert werden. Für die kurzfristige Lagerung oder den Transport können DNA-Proben bei 4℃ gelagert oder mit Kühlakkus oder Eispackungen transportiert werden. Für den langfristigen Transport werden Trockeneis und Kühlakkus empfohlen. Die Anforderungen an DNA-Proben sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1. Anforderungen an DNA-Proben.

Sequenzierungstyp	Bibliotheksart	Musteranforderung
genomische Sequenzierung	Kleine Fragmentbibliothek	≥ 300 ng, OD260/280: 1,8-2,2, Konzentration > 10 ng/μl, Volumen > 10 μl. Die DNA-Banden der Agarose-Gelelektrophorese sind klar und ohne Abbau, keine RNA- und Proteinverunreinigungen, und die Proben sind klar, farblos, klebrig und löslich.
genomische Sequenzierung	Pacbio-Bibliothek (10/20K-Bibliothek)	≥ 10μg, Konzentration > 100ng/μl, OD260/280 Verhältnis: 1,8-2,0, OD260/230 Verhältnis: 2,0-2,2. Das Verhältnis der Nanodrop-Konzentration zur Qubit-Konzentration beträgt ≤ 2, die Probe ist klar und farblos, und es gibt keine unlöslichen Stoffe; das DNA-Band in der Agarose-Gelelektrophorese ist klar und zeigt keine DNA-Zersetzung, frei von RNA- und Proteinverunreinigungen.
Metagenom-Sequenzierung		≥ 300ng, OD260/280: 1,8-2,2, Konzentration > 2ng/μl, Volumen > 10μl. Die Agarosegelstreifen sind klar und nicht signifikant degradiert.
16S/18S/ITS-Sequenzierung		≥ 15 µl, die Amplifikationsergebnis-Konzentration ≥ 10 nM und die genomische Konzentration ≥ 0,05 ng/µl.
ChIP-Seq		≥ 30ng, Konzentration ≥1ng/μl, Volumen ≥10μl, Peaks sind normalverteilt zwischen 100-500bp, mit einem Hauptpeak bei 200-400bp. Die Probe ist klar, farblos, nicht viskos, löslich und frei von Proteinverunreinigungen.
Ganzgenom-Methylierungssequenzierung		≥ 1,5 μg, das Verhältnis von 260/280 liegt zwischen 1,8-2,2, die Konzentration ≥ 20 ng/μl und das Volumen ist größer als 10 μl. Das Agarose-Gelelektrophorese-Band zeigt keine signifikante Degradation, und die Probe ist klar und farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Stoffen.
Exom-Sequenzierung	Genomprobe, praktisch keine Degradation	≥ 300 ng, 260/280-Verhältnis zwischen 1,8-2,2, Konzentration ≥ 2 ng/μl, Volumen ≥ 10 μl. Das Agarose-Gelelektrophorese-Band zeigt keine signifikante Zersetzung, und die Probe ist klar und farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Stoffen.
Exom-Sequenzierung	Spezielle Proben wie FFPE erlauben eine leichte Degradation.	≥ 400 ng, das Verhältnis von 260/280 liegt zwischen 1,8 und 2,2, die Konzentration ≥ 4 ng/μl und das Volumen ≥ 10 μl. Der Agarosegel-Elektrophorese-Band liegt über 500 bp.
Amplicon-Sequenzierung	Kleines Fragment direkt gebaute Bibliothek	≥ 150ng, 260/280-Verhältnis: 1,8-2,2, Konzentration ≥ 2ng/μl, Volumen ≥ 10μl. Die Fragmentgröße liegt zwischen 100bp und 500bp, und die Probe ist klar und farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Stoffen.
Amplicon-Sequenzierung	Muss unterbrochen werden (Segmentgröße >1000 bp)	≥ 500 ng, das Verhältnis von 260/280 liegt zwischen 1,8 und 2,2, die Konzentration beträgt ≥ 20 ng/μl und das Volumen ist ≥ 10 μl. Das Agarose-Gelelektrophorese-Band ist klar und nicht signifikant diffus, und die Probe ist klar und farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Stoffen.
Bibliotheksmuster		Die Konzentration der Bibliothek ≥ 3nM (qPCR quantitative Konzentration), die Konzentration der Lane-Bibliothek ≥ 5nM (qPCR quantitative Konzentration), das Volumen ≥ 15μl. Die Probe enthält keine magnetischen Perlen, und die Bibliothek ist mit der vorgesehenen Sequenzierungsplattform kompatibel. Weitere Hinweise: 1) Die DNA-Bibliothek ist in einem geeigneten Puffer von Illumina Resuspension Buffer (RSB) oder einem anderen Puffer gelöst. 2) Die Kunden sollten Informationen zur Art, Fragmentgröße, Methode zur Datenbankerstellung, Qualitätsinspektionsdiagramm des Agilent 2100 Bioanalyzers und Qubit-Ergebnisse bereitstellen. 3) Die Größe der HiSeq-Bibliothek liegt zwischen 300bp und 500bp, die Größe der MiSeq-Bibliothek liegt zwischen 300bp und 600bp (keine Primer-Dimer und Linker-Dimer).

RNA-Probe

RNA-Proben sollten bei -80°C gelagert werden. Trockeneis oder flüssiger Stickstoff können für die kurzfristige Lagerung oder den Transport verwendet werden. Für den langfristigen Transport wird empfohlen, die RNA in 75% Ethanol zu präzipitieren und in ausreichendem Trockeneis oder blauen Eis (2 kg/Tag) zu transportieren. Die Anforderungen an RNA-Proben sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2. RNA-Probenanforderungen.

Sequenzierungstyp	Artenart	Musteranforderung
PolyA-Screening-Bibliothek	Säugetiere	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 28S/18S ≥ 1.0, Konzentration > 50ng/μl, Volumen ≥ 10 μl, normaler 5S-Peak. 2100 Peakform ist normal, die Probe ist klar und farblos, nicht viskos, keine unlöslichen Stoffe.
	Insekten	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, Konzentration > 50ng/μl, Volumen ≥ 10μl, kein Anstieg (Löschung) am Ausgangswert, normaler 5S-Peak. 2100-Peakform ist normal, die Probe ist klar und farblos, nicht viskos, keine unlöslichen Stoffe.
	Pflanzen, Pilze, Hefe, andere Tiere	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 6.5, 28S/18S ≥ 1.0, Konzentration > 50ng/μl, Volumen ≥ 10μl, 5S-Peak ist normal. 2100 Peakform ist normal, die Probe ist klar und farblos, nicht viskos, keine unlöslichen Stoffe.
rRNA-Entfernungsbibliothek	Eukaryotische Organismen (lncRNA)	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 23S/16S ≥ 1.0, Konzentration > 100 ng/μl, Volumen ≥ 10μl, 5S-Peak ist normal.
rRNA-Entfernungsbibliothek	Prokaryoten	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 23S/16S ≥ 1.0, Konzentration > 100 ng/μl, Volumen ≥ 10μl, 5S-Peak ist normal. Die Probe ist klar, farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Bestandteilen.
Kleine RNA-Sequenzierung	Säugetiere	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 8, 28S/18S ≥ 1.0, Konzentration > 170ng/μl, Volumen ≥ 10μl, normaler 5S-Peak. Die Probe ist klar, farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Stoffen.
	Insekten	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, Konzentration > 170 ng/μl, Volumen ≥ 10μl, keine Erhöhung am Ausgangswert, normaler 5S-Peak. Die Probe ist klar, farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Bestandteilen.
	Pflanzen, Pilze, Hefe, andere Tiere	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7.5, 28S/18S ≥ 1.0, Konzentration > 170 ng/μl, Volumen ≥ 10μl, normaler 5S-Peak. Die Probe ist klar, farblos, nicht viskos und frei von unlöslichen Stoffen.
Makro-Transkriptom		≥ 3μg, Konzentration ≥ 100ng/μl, RIN ≥ 6,5, Volumen ≥ 10μl, die Probe ist klar und farblos, nicht viskos, keine unlöslichen Stoffe.
Vollständige Transkriptom-Sequenzierung		3-5μg oder mehr, Konzentration ≥ 500ng/μl, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 9, 23S/16S ≥ 1.0, das Volumen ≥ 10μl, und der 5S-Peak ist normal.

Gewebeprobe

Wenn DNA isoliert werden soll, können Gewebeproben für kurze Zeit gelagert oder transportiert werden und sollten bei 4 °C aufbewahrt oder transportiert werden. Für den langfristigen Transport werden Trockeneis und Kühlakkus empfohlen. Wenn RNA extrahiert werden soll, sollten Gewebeproben mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff transportiert werden. Bitte kennzeichnen Sie den Probenahmen deutlich, platzieren Sie das Probenröhrchen in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen oder einer Probenbox und wickeln Sie es dann ordnungsgemäß mit Schaumstoff oder Baumwolle ein, um sicherzustellen, dass die Probe in gutem Zustand an unserem Labor ankommt.

Die Anforderungen an Gewebeproben sind in Tabelle 3 und 4 dargestellt.

DNA Die DNA-Ausbeuten verschiedener Probenarten variieren stark. Bitte reichen Sie Proben gemäß den tatsächlichen Bedingungen der Proben und den Anforderungen an den Aufbau der Sequenzierungsbibliothek ein. Gewebeproben für DNA-bezogene Sequierungsdienste sollten mit Kühlakkus versendet werden.

Tabelle 3. Anforderungen an Gewebeproben für die DNA-Sequenzierung.

Probenart	Musteranforderung
Blut	≥ 2 ml frisches oder kryokonserviertes Antikoagulans (Vollblut oder aus Vollblut extrahierte weiße Blutkörperchen), EDTA-Antikoagulans wird empfohlen, und Heparin-Antikoagulans darf nicht verwendet werden, um die Experimente nicht zu beeinträchtigen.
Isoliertes Gewebe	≥ 0,5 g tierisches Gewebe, ≥ 2 g pflanzliches Gewebe.
Zelle	≥ 5X10⁶
Bakterielle Probe	≥ 1 g des bakteriellen Körpersediments (etwa ≥ 10 ml in der logistischen Wachstumsphase der bakteriellen Flüssigkeit); Pacbio-Bibliothek: ≥ 15 g des bakteriellen Körpers sind erforderlich, um zu sedimentieren (etwa ≥ 150 ml in der logistischen Wachstumsphase).
FFPE-Probe	Mindestens 10 Schnitte ohne HE-Färbung, die Dicke von ≥ 5 Mikrometern, die Fläche des Gewebes auf dem Schnitt sollte ≥ 25 Quadratmillimeter betragen, wobei die Anzahl der nukleierten Zellen mehr als 80% aller Zellen ausmacht und der Gehalt an Tumorzellgewebe ≥ 70% beträgt.
16S/ITS/18S Sequenzierungsprobe	Fällige Menge > 2g, Volumen > 10ml, das speziell entsprechend der Häufigkeit des Mikroorganismus bestimmt wird.
Metagenomische Probe	Umweltproben: 5-10g Boden; 3-5g Fäkalien; 5-10g Sediment; 25ml Lösung. Wasser: Volumen: 5-10ml, durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22μm oder 0,45μm geleitet.

RNA Die RNA-Ausbeuten verschiedener Probenarten variieren stark. Bitte reichen Sie Proben entsprechend den tatsächlichen Bedingungen der Proben und den Anforderungen an den Aufbau der Sequenzierungsbibliothek ein. Gewebeproben für RNA-bezogene Sequenzierungsdienste werden mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff transportiert, sofern nicht anders angegeben.

Tabelle 4. Gewebeprobenanforderungen für RNA-Sequenzierung.

Probenart	Musteranforderung
Blut	≥5 ml Lymphozyten, die aus Vollblut gesammelt wurden. Die Menge der Proben von Vögeln oder Fischen kann entsprechend reduziert werden. Es wird empfohlen, die Lymphozyten vollständig mit 20 Volumina TRIzol LS zu lysieren. Kunden können auch Vollblutproben, die mit flüssigem Stickstoff gefroren wurden, einsenden. Es wird empfohlen, 3 Volumina TRIzol LS-Lyseflüssigkeit zu frischem Blut hinzuzufügen und es mit Trockeneis zu versenden. Die Kunden tragen das Risiko der Probenentnahme.
Frisches Gewebe	≥ 500 mg. Oder erhöhen Sie die Probenmenge, wenn die Probe Muskelgewebe oder Fett enthält, da diese einen niedrigen RNA-Gehalt aufweisen. ≥ 1 g Pflanzengewebe. Bei komplexen Pflanzengeweben, die Polysaccharid-Polyphenole enthalten, senden Sie bitte so viele Proben wie möglich. Frisches Gewebe sollte nach dem Waschen in Alufolie eingewickelt oder in EP-Röhrchen verpackt und innerhalb von 3 Minuten mit flüssigem Stickstoff gefroren werden.
Zelle	≥ 5X10⁶Bitte waschen Sie das Pellet und fällen Sie es, vollständig mit TRIzol lysiert, und senden Sie es.
Bakterielles Muster	≥ 500 mg des Niederschlags frischer Bakterien werden innerhalb von 3 Minuten schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Pilzproben werden nicht für die Konservierung in TRIzol-Lyse empfohlen.
Hochdurchsatz-Sequenzierungsprobe	Kunden sammeln PBMC-Blut-Zellen; Die Gesamtzahl der Zellen liegt zwischen 1X10.⁶-5X10⁶vollständig lysiert mit 1 ml TRIzol; senden Sie es mit Trockeneis.

Zusätzliche Lektüren

Die Methoden zur DNA-Extraktion und -Reinigung

Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ohne Verwendung von Kits isolieren

Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.

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