Plasmid-DNA aus bakteriellen Kulturen ohne Verwendung von Kits isolieren

Einführung

Viele molekularbiologische Techniken, wie zum Beispiel vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung, erfordern hochreines und konzentriertes Plasmid-DNA, und bakterielle Plasmide werden häufig als Klonierungsvektoren für die DNA-Rekombination verwendet. Nach dem Bau eines neuen Plasmids können seine Größe und das Spektrum der Restriktionsendonukleasen durch Gelelektrophorese bestimmt werden. Dieser Artikel wird zwei effektive Protokolle zur Plasmidextraktion ohne Verwendung von Kits vorstellen.

Protokoll A

Ausrüstung

• Desktop-Mikrozentrifuge
• Desktop-Vortexer

Reagenzien

• Denaturierungslösung
• Renaturierungslösung
• 100 % Ethanol oder Isopropanol
• 70 % Ethanol
• TE-Puffer oder Wasser

Protokoll

1. Züchte über Nacht eine Bakterienkultur.

Zentrifugieren Sie die Kultur, um Bakterien vor der DNA-Präparation zu sedimentieren.

3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterien in Puffer.

4. Fügen Sie eine denaturierende Lösung zu den resuspendierten Bakterien hinzu, um die Bakterienlyse zu verursachen und deren Inhalte freizusetzen.

5. Fügen Sie eine Renaturierungslösung zu den denaturierten Bakterien hinzu, um Proteine und genomische DNA auszufällen und Plasmide in Lösung frei zu lassen.

6. Fäll das Protein und die genomische DNA durch Zentrifugation aus und entferne den Überstand, der die Plasmide enthält.

7. Fügen Sie entweder Ethanol oder Isopropanol hinzu, um die Plasmid-DNA auszufällen.

8. Fäll das DNA mit einer Zentrifuge aus oder wende die Lösung auf eine Säule an, die an die DNA bindet.

9. Waschen Sie das Pellet oder die Säule mit 70% Ethanol, um überschüssiges Salz zu entfernen.

10. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet oder eluieren Sie die DNA von der Säule mit Wasser oder einem neutralen Puffer wie TE.

Protokoll B: die alkalische Extraktionsmethode

Ausrüstung

• Eppendorf-Typ (1,5 ml) Polypropylenröhrchen
• Eine Tischzentrifuge, die in der Lage ist, 8-10.000 xg zu erzeugen.

Reagenzien

• Lösung I: Lysozym-Lösung - 2 mg/ml Lysozym, 50 mM Glukose, 10 mM CDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)
• Lösung II: Alkalische SDS-Lösung - 0,2 N NaOH, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS)
• Lösung II: Hochsalzlösung - 3 M Natriumacetat (pH 4,8)
• 0,1 M Natriumacetat/0,05 M Tris-HCl (pH 8)
• Kaltes Ethanol

Protokoll

1. Züchte über Nacht eine Bakterienkultur.

Übertragen Sie 0,5 ml Kultur in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen zur Plasmidextraktion.

3. Zentrifugieren Sie die Kultur, um die Bakterien zu pelleten, bevor Sie mit der DNA-Präparation fortfahren.

4. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 100 µl Lösung I hinzu, resuspendieren Sie das Zellpellet und inkubieren Sie es 30 Minuten bei 0 °C.

5. Fügen Sie 200 µl Lösung II hinzu und drehen Sie vorsichtig. Die Suspension sollte nahezu klar und leicht viskos werden. Halten Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 0 °C.

6. Fügen Sie 150 µl von Lösung III hinzu und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch Inversion für einige Sekunden vorsichtig, währenddessen ein DNA-Gerinnsel entsteht. Das Röhrchen wird 60 Minuten lang bei 0 °C aufbewahrt.

7. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 10.000 xg.

8. Entfernen Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in ein zweites Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 1 ml kaltes Ethanol hinzu und lagern Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei -20 °C.

9. Sammeln Sie das Präzipitat durch Zentrifugation für 2 Minuten.

10. Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 100 µl 0,1 M Natriumacetat/0,05 M Tris-HCl (pH 8) auf und fällen Sie es erneut mit 2 Volumina kaltem Ethanol für 10 Minuten bei -20℃ aus.

Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 10.000 xg und lösen Sie die Pellets in 40 μl Wasser auf.

Bei CD Genomics bieten wir vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung um Ihnen zu helfen, die Evolution von Plasmiden, ihre modulare Struktur und die Existenz von Hotspots für die Einfügung von accessory genes zu untersuchen.

Zusätzliche Lektüren

Die Methoden zur DNA-Extraktion und -Reinigung

Richtlinien zur Probenübermittlung für Hochdurchsatz-Sequenzierung

Referenz:

1. 1. Bimboim H C, Doly J. Ein schnelles alkalisches Extraktionsverfahren zum Screening von rekombinanter Plasmid-DNA. Nukleinsäurenforschung, 1979, 7(6):1513-1523.