Die Methoden zur DNA-Extraktion und -Reinigung

Eine kurze Einführung in die DNA

Desoxyribonukleinsäure ist eines der wichtigsten lebensbasierten Moleküle, das genetische Anweisungen trägt, um die biologische Vererbung, die biologische Entwicklung und die lebenswichtigen Funktionen zu steuern. Die Struktur der DNA in eukaryotischen Zellen wird als Doppelhelix bezeichnet, die durch antiparalleles Wickeln von zwei Polynukleotidketten gebildet wird. Die DNA-Extraktion ist ein kritischer und grundlegender Schritt in molekularbiologischen Experimenten. In vielen Laboren wird die alkalische Lyse-Methode verwendet, um DNA zu extrahieren. Für eine erfolgreiche DNA-Extraktion gibt es mehrere Messkriterien; es ist erforderlich, die Integrität der Primärstruktur der Nukleinsäure sicherzustellen, A260/A280=1,8~2,0, die niedrige Konzentration von Salzionen und die minimale Kontamination mit anderen Biomakromolekülen wie Proteinen, Polysacchariden und Lipidmolekülen. Hochwertige und gereinigte DNA ist sehr wichtig für die nachgelagerte Forschung, wie genomische Forschung und epigenomische Forschung.

DNA-Extraktion aus kultivierten Zellen in vitro

1. Zellen sammeln. (Die Zellen werden direkt zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten, und die adhärenten Zellen müssen mit Trypsin verdaut und durch Zentrifugation gesammelt werden.)

2. Die Zellen resuspendieren und einmal mit vorgekühltem PBS spülen.

3. Wiederhole Schritt 2.

Fügen Sie 2 mL Puffer zur DNA-Extraktion (10 m mol/L Tris-Cl, 0,1 mol/L EDTA, 0,5% SDS) hinzu und mischen Sie.

5. Fügen Sie Proteinase K zu einer Endkonzentration von 100 μL/mL hinzu und führen Sie ein Wasserbad bei 50 °C für 3 Stunden durch.

6. Fügen Sie ein gleiches Volumen Phenol hinzu, zentrifugieren Sie bei 2.500 U/min für 15 Minuten und sammeln Sie die wässrige Phase.

7. Fügen Sie ein gleiches Volumen einer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung hinzu, zentrifugieren Sie bei 2.500 U/min für 15 Minuten und sammeln Sie die wässrige Phase.

8. Fügen Sie 0,1 Volumen 3M Natriumacetat und 3 Volumen vorgekühltem, absolutem Ethanol bei -20 °C über Nacht hinzu.

9. Zentrifugieren bei 12.000 U/min für 10 Minuten unter 4 °C.

10. Waschen Sie zweimal mit 80% vorgekühltem Ethanol.

11. Resuspendieren Sie das weiße Pellet in einer geeigneten Menge TE-Puffer oder ddH.₂Die resultierende Lösung ist die zelluläre DNA.

DNA-Reinigung und -Konzentration

• Ethanolpräzipitation von DNA

1. Platzieren Sie die DNA-Lösung in einem Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 3 Volumen vorgekühltem absolutem Ethanol bei -20 °C über Nacht hinzu.

Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 14.000 U/min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.

3. Waschen Sie zweimal mit 80% vorgekühltem Ethanol.

4. Resuspendieren Sie das weiße Pellet in einer geeigneten Menge TE-Puffer oder ddH.₂O. Die resultierende Lösung ist die zelluläre DNA.

Natriumacetat liefert Salzionen für die Fällung von DNA, die etwas mehr hinzugefügt werden können und schließlich entfernt werden müssen. Ein Teil der DNA geht während des Prozesses der DNA-Reinigung und -Konzentration verloren, und die Rückgewinnung von DNA beträgt etwa 80 %.

• Isopropanol-Fällung von DNA

0,7-mal das Volumen von Isopropanol bei Raumtemperatur wird hinzugefügt (zum Beispiel werden 0,7 mL Isopropanol zu 1 mL des zu konzentrierenden Plasmids hinzugefügt). Nach dem Mischen wird die Mischung 10 Minuten lang bei 14.000 U/min bei 4 °C zentrifugiert, und der Überstand wird vorsichtig abgezogen, um Kontakt mit dem Niederschlag zu vermeiden. Beachten Sie, dass die durch Isopropanol ausgefällte DNA ein glasiger, nahezu transparenter, körniger Niederschlag ist, der im Vergleich zu salzhaltigen Niederschlägen, die durch Ethanolfällung entstehen, schwer zu erkennen ist. Zentrifugieren Sie das Zentrifugenrohr so sanft wie möglich, um lockeren Sediment oder einige Partikel, die in der Lösung schwebend sind, zu vermeiden. Gießen Sie den Überstand nicht direkt ab. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand vorsichtig abzusaugen, und achten Sie darauf, das Ansaugen zu vermeiden.

Zusätzliche Lektüren:

Richtlinien zur Probenübermittlung für Hochdurchsatz-Sequenzierung

Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ohne Verwendung von Kits isolieren

Referenzen:

1. Ayoib Adilah, Hashim Uda, Gopinath Subash C B u. a.DNA-Extraktion auf Bio-Chip: Geschichte und Überlegenheit gegenüber konventionellen und Festphasenextraktionsmethoden. Appl. Mikrobiol. Biotechnol., 2017, 101(22): 8077-8088.
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4. Bitting Anna L, Bordelon Hali, Baglia Mark L u. a.Automatisiertes Gerät zur asynchronen Extraktion von RNA-, DNA- oder Protein-Biomarkern aus Stellvertreterpatientenproben. J Lab Autom, 2016, 21(6): 732-742.
5. Casaril Aline Etelvina, de Oliveira Liliane Prado, Alonso Diego Peres u. a.Standardisierung der DNA-Extraktion aus Sandfliegen: Anwendung auf die Genotypisierung durch Next-Generation-Sequenzierung.Exp. Parasitol, 2017, 177: 66-72.