Protokoll zur Gesamtrna-Extraktion/-Reinigung

Der Erwerb von hochwertiger RNA ist der erste und entscheidende Schritt bei der Durchführung von RNA-Analysen, einschließlich PCR, reverser Transkription in Echtzeit-PCR (RT-qPCR), Genexpressionsprofilierung mit Mikroarray, RNA-Sequenzierungund nördliche Analyse usw. Die totale RNA-Extraktion (auch bekannt als RNA-Reinigung) ist der Prozess, RNA-Moleküle aus biologischen Proben wie Zellkulturen, Gewebe, FFPE und Blut zu extrahieren. Die wichtigsten Aspekte im RNA-Reinigungsprozess sind RNA-Integrität, Reinheit und ausreichende Menge. Hochwertige RNA ist frei von genomischer DNA oder Hemmstoffen und ist nicht degradiert.

Als Nächstes werden wir eine manuelle Methode zur RNA-Extraktion/-Reinigung vorstellen, die für alle Gewebearten der meisten Pflanzen- und Tierarten geeignet ist. Das Protokoll kann zwischen den Wissenschaftlern leicht variieren. Sie können auch kommerziell erhältliche Kits wählen, die Spin-Spalten oder magnetische Perlen verwenden. RNA ist sehr instabil, daher sollten alle Reagenzien und Materialien frei von RNase sein.

Materialien:

• Frisches TRIzol-Reagenz: 40% w/w Phenol, 1M Guanidinthiocyanat, 1M Ammoniumthiocyanat, 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH=5,0), 5% w/w Glycerin
• Chloroform-Isopropylalkohol-Mischung (24:1)
• 100 % Isopropanol
• 70% Ethanol
• 10 M LiCl
• Frisches RNase-freies ddH₂O oder autoklaviertes 1xTE

Ausrüstung und Verbrauchsmaterialien

• MM300 Mischmühle
• Tischmikrozentrifuge
• Vortexer
• Pipettoren
• Mikrozentrifugenröhrchen

1. Frieren Sie ein 2 ml Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen mit Gewebeprobe und Glasball bei -80 °C ein und mahlen Sie die Probe dann zwei Minuten lang im MM300 Mixer Mill bei 30 Hz.

Fügen Sie 1 ml frisches TRIzol-Reagenz zur mechanisch zerkleinerten Gewebeprobe hinzu, vortexen Sie gut und inkubieren Sie die Probe 5 Minuten bei Raumtemperatur.

Fügen Sie 0,2 ml Chloroform zu dem Mikrozentrifugenröhrchen für die Homogenisierung hinzu. Vortexen Sie gut und inkubieren Sie die Probe 3 Minuten bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie die Probe bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischmikrozentrifuge bei 4 °C für 5 Minuten.

Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dem frischen Mikrozentrifugenröhrchen ein gleiches Volumen Chloroform hinzu und vortexen Sie gut. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischmikrozentrifuge.

Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine gleiche Menge Isopropanol zu dem frischen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und vortexen Sie gut. Zentrifugieren Sie bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischmikrozentrifuge bei 4 °C für 10 Minuten.

7. Waschen Sie das Pellet mit 1,5 ml 70% Ethanol. Zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischmikrozentrifuge.

8. Lösen Sie das Pellet in 400 μl 1xTE bei 55°C gut mit einem Vortex auf. Fügen Sie der Lösung ein gleiches Volumen von 10 M LiCl hinzu und kühlen Sie sie für mehrere Stunden (oder über Nacht) bei -20°C.

9. Drehen Sie das Röhrchen bei maximaler Geschwindigkeit in der Tischmikrozentrifuge bei 4 °C für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn (enthält DNA und kleine RNA < 200 nt).

10. Waschen Sie das Pellet mit 1,5 ml 70% Ethanol, gut vortexen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischmikrozentrifuge bei 4 °C für 10 Minuten. Entsorgen Sie das Ethanol, das Pellet nicht trocknen.

11. Lösen Sie das Pellet in 200-400 μl frischem RNase-freiem ddH auf.₂O oder 1xTE.

Wie überprüft man die Qualität von RNA?

Die Elektrophorese kann zur Qualitätskontrolle von RNA verwendet werden, einschließlich Menge und Integrität. Laden Sie 5 μl der Lösung auf ein Standard-1,5 %-Agarosegel mit 1xTHE-Puffer. Fügen Sie Ethidiumbromid (EB) zum Gel hinzu. Laden Sie eine bekannte Menge DNA in einen benachbarten Kanal, um als Konzentrationsstandard zu dienen. Intakte RNA zeigt scharfe Bänder ribosomaler RNA.

Zusätzliche Lektüren:

Die Methoden zur DNA-Extraktion und -Reinigung

Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ohne Verwendung von Kits isolieren

Richtlinien zur Probenabgabe für Hochdurchsatz-Sequenzierung