Die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) revolutioniert die Erkennung von Krankheitserregern.

In den letzten Jahren hat sich die Landschaft der Sequenzierungstechnologien grundlegend gewandelt, indem sie von Forschungseinrichtungen in den Bereich der klinischen Labore übergegangen ist. Diese Transformation wurde durch rasante technologische Fortschritte und erhebliche Kostenreduktionen vorangetrieben. Trotz einer Vielzahl von Mikroorganismen, die menschliche Infektionen verursachen können, kratzen die gängigen Diagnosetechniken nur an der Oberfläche und lassen eine große Anzahl von Krankheitserregern unidentifiziert. Diese anhaltende Herausforderung wird durch das kontinuierliche Auftreten neuer Krankheitserreger weiter verschärft. metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (mNGS), ein umfassender und präziser Ansatz zur mikrobiellen Detektion und taxonomischen Charakterisierung. Während zahlreiche Studien und Fallberichte die Wirksamkeit von mNGS bei der Verbesserung der Diagnose, Behandlung und Verfolgung von Infektionskrankheiten unterstreichen, stehen auf dem Weg nach vorne nach wie vor erhebliche Hindernisse.

Bitte lesen Sie unseren Artikel. Anwendungen der Metagenomik in der Biotechnologie und Gesundheitsversorgung.

Die Kraft der NGS entfesseln

Die Evolution der Sequenzierungstechnologien von den Methoden der ersten Generation hin zu dem anspruchsvollen Bereich der Next-Generation-Sequenzierungstechnologien, auch allgemein bekannt als NGS oder Hochdurchsatz-Sequenzierunghat effektiv die Herausforderungen mit niedrigem Durchsatz, die die ursprünglichen Techniken plagten, gemildert. Seit dem Jahr 2000 hat der Aufstieg der massiv parallelen Sequenzierungstechnologien eine Revolution in den Hochdurchsatz-Sequenzierungskapazitäten eingeleitet. Kritische Durchbrüche, einschließlich Pyrophosphat-Sequenzierung, reversibler Terminator-Chemikalien-Sequenzierung und unterstützter Oligonukleotid-Ligation und -Sequenzierung, haben einen monumentalen Anstieg des Durchsatzpotenzials katalysiert. Bemerkenswerterweise hat sich dieser Fortschritt parallel zu einer dramatischen Senkung der Sequenzierungskosten vollzogen, was den Zugang zu diesen hochmodernen Werkzeugen weiter demokratisiert hat.

Das Versprechen der Langlese-Sequenzierung

Die LangsequenzierungstechnologienNanopore und PacBio-Sequenzierung), alternativ als Einzelmolekül-Sequenzierung bezeichnet, stehen als Zeugnis für Innovation. Im Gegensatz zu NGS bieten diese Technologien die Fähigkeit, beeindruckende zehn Nukleotide pro Sekunde zu erkennen, was zu einer erheblichen Verkürzung der Sequenzierungszeit führt. Über die Geschwindigkeit hinaus ermöglichen diese Technologien die Ableitung vollständiger mRNA-Sequenzen durch ihre ultra-langen Lese-Längen. Ein außergewöhnliches Merkmal von Langlese-Sequenzierern ist ihre Fähigkeit, rohe DNA/RNA-Proben direkt zu sequenzieren, wodurch die Notwendigkeit einer PCR-Amplifikation entfällt. Darüber hinaus zeigen sie einen unvoreingenommenen Ansatz gegenüber CG-Nukleotiden und bieten die direkte Erkennung und Abruf von Methylierungsinformationen. Trotz dieser bemerkenswerten Vorteile ist jedoch die Integration von Langzeit-Sequenzierung in klinischen Anwendungen bleibt begrenzt aufgrund seiner erhöhten Fehlerquote und der damit verbundenen finanziellen Einschränkungen.

Den Weg vom Nasslabor zum Trockenlabor navigieren

Die Hochdurchsatz-Sequenzierung von Krankheitserregern erfordert einen zweifachen Prozess: experimentelle Arbeiten im Labor und anschließende bioinformatische Analysen. Die Laborarbeiten umfassen die Probenvorbehandlung, die Nukleinsäureextraktion, den Aufbau von Bibliotheken und schließlich die Sequenzierung. In der Zwischenzeit umfasst die bioinformatische Analyse im Trockenen Aufgaben wie die Qualitätskontrolle der Daten, die Eliminierung menschlicher Sequenzen, den Vergleich von Sequenzen mikrobieller Arten und die Analyse von Arzneimittelresistenz- oder Virulenzgenen.

Pathogenlösungs-Workflow. (Sam et al., 2021)

Enthüllung des Prozesses: Schlüsselphasen

• Probenentnahme: Die Präzision bei der Entnahme von Proben an der primären Infektionsstelle erhöht die Nachweisraten erheblich.
• Beispiel für die Vorbehandlung: Verschiedene Proben erfordern unterschiedliche Vorbehandlungsstrategien – Liquefaktion für Sputum, Entwachsung für FFPE-Proben und Homogenisierung für Gewebe. Techniken wie Filtration, differentielle Zentrifugation, DNA-Enzym-Hydrolyse und Behandlung mit Methylierungsreagenzien verringern den Anteil an menschlicher DNA in den Proben.
• Nukleinsäureextraktion: Für die DNA- und RNA-Extraktion sind unterschiedliche Protokolle erforderlich.
• Bibliothekskonstruktion: Die Wahl der Methoden zur Bibliothekskonstruktion stimmt mit der Sequenzierungsplattform und dem beabsichtigten Zweck überein.
• Sequenzierung: Führende Plattformen der nächsten Generation, wie die von Illumina und UW Genetics angebotenen, dominieren diese Phase.
• Bioinformatische Analyse: Die Rohdatenanalyse bildet die Grundlage für die anschließende Identifizierung von Arten und Antibiotikaresistenzgenen.
• Berichterstattung: Analyseergebnisse erleichtern die Identifizierung potenzieller Krankheitserreger.

NGS: Revolutionierung der Pathogenidentifikation

Whole-Genome-Nächste-Generations-Sequenzierung steht als ein Leuchtturm des Fortschritts und ermöglicht eine schnelle, umfassende Identifizierung von Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten. Dieser Ansatz beseitigt die Notwendigkeit a priori Annahmen über den ursächlichen Erreger und bietet im Vergleich zu herkömmlichen kulturbasierten Methoden eine unvergleichliche Sensitivität und Genauigkeit. mNGS erweist sich als besonders effektiv bei der Identifizierung von Mykobakterien, Anaerobiern, atypischen Erregern und Viren und zeigt auch in Anwesenheit von Antibiotika Widerstandsfähigkeit. Dieses Potenzial für präzise Diagnosen und Differentialdiagnosen von Infektionskrankheiten wurde durch eine Vielzahl von Studien validiert.

Zusammenfassend

Die Reise der Sequenzierungstechnologien von den Fluren der Forschung an die Spitze der klinischen Diagnostik wurde durch technologische Sprünge und Kostenreduktionen vorangetrieben. Metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) stellt einen Paradigmenwechsel dar und bietet eine ganzheitliche und zuverlässige Strategie zur mikrobiellen Erkennung und taxonomischen Profilierung. Während die Erfolge bei der Nutzung von mNGS für die Krankheitsdiagnose und -behandlung bemerkenswert sind, stehen dennoch erhebliche Herausforderungen zur Lösung an. Durch das unermüdliche Streben nach Präzision ist die klinische Mikrobiologie bereit, die Diagnostik und Behandlung von Infektionskrankheiten neu zu definieren.

Referenz:

1. Sam, Soya S. u. a."Bewertung eines Metagenomik-Assays der nächsten Generation zur Erkennung und Quantifizierung von DNA-Viren in Plasma von Transplantationsempfängern." Das Journal für Molekulare Diagnostik 23.6 (2021): 719-731.