Protokoll zur Sequenzierung von zellfreier DNA im Plasma

1. Sammeln Sie 5 ml peripheres Blut mit separaten EDTA-Blutprobenröhrchen.
2. Extrahiere das maternale Plasma durch ein zweistufiges Zentrifugationsverfahren innerhalb von 8 Stunden nach der Blutentnahme. Zentrifugiere das maternale Blut zunächst 10 Minuten bei 1600×g und 4°C und überführe 1 ml des Überstands in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für eine zweite Zentrifugation bei 16000×g für 10 Minuten bei 4°C. Übertrage dann den Großteil des maternalen Plasmas in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Achte darauf, dass du beim Übertragen des maternalen Plasmas keine Leukozytenschicht oder Bodensedimente entfernst.
3. Extrahiere cfDNA aus 300μL mütterlichem Plasma mit einem Circulating DNA Isolation Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mische kurz 20μL Proteinase K und 25μL Pure Particle G mit 300μL mütterlichem Plasma in einem neuen 1,5ml Eppendorf-Röhrchen. Gründlich mischen und 550μL Lysis-Puffer hinzufügen. Kurz vortexen und das Eppendorf-Röhrchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf ein magnetisches Trenngerät stellen.
4. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand und mischen Sie die verbleibenden Perlen mit 700 μL Waschpuffer 1. Vortexen Sie kurz und platzieren Sie das Eppendorf-Röhrchen für 1 Minute auf einem magnetischen Trenngerät.
5. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Überstand und mischen Sie die verbleibenden Perlen mit 700 μL Waschpuffer 2 (stellen Sie sicher, dass Ethanol hinzugefügt wurde). Vortexen Sie kurz und platzieren Sie das Eppendorf-Röhrchen für 1 Minute auf einem magnetischen Trenngerät.
6. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand und wiederholen Sie die Waschung mit 700 μL Waschpuffer 2. Stellen Sie das Eppendorf-Röhrchen auf ein magnetisches Trenngerät, um den gesamten Überstand sorgfältig zu entfernen, und lassen Sie es dann 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.
7. Fügen Sie 50 μL Elutionspuffer hinzu, vortexen Sie kurz und lassen Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Stellen Sie das Eppendorf-Röhrchen auf ein magnetisches Trenngerät und entfernen Sie den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen.
8. Bestimmen Sie die Quantifizierung der extrahierten Plasma-cfDNA mit einem Qubit dsDNA HS Assay-Kit und bestimmen Sie die DNA-Fragmentgröße mit einem Agilent 2100-Kit auf einer Bioanalyzer 2100-Plattform. Plasma-cfDNA sollte einen Fragmentgipfel bei 166–170 bp aufweisen.
9. Stellen Sie die cfDNA-Bibliothek mit einem Cell-free DNA Library Prep Set gemäß den Anweisungen des Herstellers her. Verwenden Sie 5 ng cfDNA, um die Endreparatur und A-Tailing durchzuführen. Adapter mit spezifischen Barcodes werden an die cfDNA-Fragmente ligiert, und das Ligationsergebnis wird mit den bereitgestellten Reinigungskügelchen gereinigt.
10. Nach der Reinigung wird die DNA durch 12 Zyklen PCR amplifiziert und einer weiteren Runde der Reinigung gemäß den Anweisungen des Kits unterzogen. Quantifizieren Sie die PCR-Produkte mit dem dsDNA HS Assay Kit. Der erforderliche Ertrag für PCR-Produkte beträgt ≥2 ng/μL.
11. Denaturieren Sie die PCR-Produkte bei 95 °C für 3 Minuten in einem PCR-Thermocycler. Mischen Sie die denaturierte DNA mit dem Zirkularisierungsreaktionsgemisch und inkubieren Sie es bei 37 °C für 30 Minuten, um einzelsträngige DNA-Kreise zu erzeugen.
Verwenden Sie 20 μL des zirkularisierten ssDNA-Produkts für die Sequenzierung gemäß dem Handbuch für die Anweisungen zum Hochdurchsatz-Sequenzierungssatz.
13. Quantifizieren Sie 2 μL von DNBs mit dem ssDNA-Assay-Kit und dem Qubit-Fluorometer. Eine Mindestkonzentration von 8 ng/μL ist erforderlich.
14. Laden Sie jede DNB-Vorbereitung auf eine separate Bahn, um sie gemäß dem Protokoll des Herstellers für 100 bp Paired-End (PE) Sequenzierung zu verarbeiten. Andere Sequenziergeräte können verwendet werden, jedoch müssen die Sequenzierungs-Oligonukleotide und -bedingungen angepasst werden.