mRNA-Sequenzierung vs. Gesamt-RNA-Sequenzierung

RNA-Sequenzierung, auch bekannt als RNA-Seq, ist ein äußerst leistungsfähiger und umfassender Ansatz zur Untersuchung des Transkriptoms von Zellen. Der Prozess der RNA-Seq dreht sich um den Aufbau einer Bibliothek von komplementärem DNA (cDNA) für die Sequenzierung. Zu Beginn der Bibliothekskonstruktion wird die zelluläre RNA zuerst isoliert, gefolgt von Qualitätskontrollen, um die Integrität der RNA zu überprüfen. Anschließend kann die interessierende RNA in der Bibliothek durch Entfernung oder Screening-Techniken angereichert werden, bevor sie in cDNA umgeschrieben wird, bevor die Sequenzierung erfolgt.

RNA-Seq findet umfangreiche Anwendungen, die von grundlegenden Erkundungen der zellulären Struktur und Funktion bis hin zur Identifizierung und Analyse verschiedener Krankheitszustände in klinischen Proben reichen. Diese Technologie ermöglicht sowohl die qualitative als auch die quantitative Erkennung zahlreicher RNAs in biologischen Proben zu bestimmten Zeitpunkten. Zum Beispiel können Veränderungen in der Genexpression vor und nach einer therapeutischen Intervention verglichen werden, um das Vorhandensein oder Fehlen einer Krankheit zu bestimmen. Darüber hinaus kann RNA-Seq selektive Spleißmuster, posttranskriptionale Modifikationen und Exon-Intron-Grenzen identifizieren. Die gewonnenen Daten bieten wertvolle Einblicke in zugrunde liegende zelluläre Mechanismen, die Struktur des Genoms, krankheitsverursachende Effekte und vieles mehr.

Gesamt-RNA-Sequenzierung

Total RNA-Seq, auch bekannt als Ganztranskriptom-Sequenzierung, ist eine umfassende Methode, die die Sequenzierung aller RNA-Moleküle, sowohl kodierender als auch nicht-kodierender, umfasst. Bei diesem Ansatz wird RNA sequenziert, nachdem ribosomale RNA (rRNA) entfernt wurde, was zu einer vielfältigen Sammlung von RNA-Molekülen führt. Die anfängliche Isolation von totaler RNA ergibt ein Gemisch aus verschiedenen RNAs, wie rRNAs, Vorläufer-mRNA (pre-mRNAs), mRNA (mRNAs) und verschiedenen Arten von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs), einschließlich Transfer-RNAs (tRNAs). Mikro-RNAs (miRNAs)und lange Fragmente von nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) die nicht in Proteine übersetzt werden (Transkripte länger als 200 Nukleotide).

Verschiedene RNA-Subtypen. (Cui et al., 2022)

Total RNA-Seq bietet Einblicke in sowohl kodierende RNAs als auch nicht-kodierende RNAs (z. B. lncRNAs und miRNAs) und liefert wertvolle Informationen über regulatorische Regionen, allgemeine Transkriptexpressionsniveaus, Spleißmuster sowie die Identifizierung von Exons, Introns und deren Grenzen.

Während der Sequenzierung können viele lncRNA-Reads mit mRNAs überlappen. Es ist bemerkenswert, dass etwa 20 % der Gene im menschlichen Genom von entgegengesetzten Strängen transkribiert werden, was zu überlappenden Regionen führt. Folglich sind strangspezifische Total-RNA-Sequenzierungsmethoden notwendig, um zwischen diesen Strängen zu unterscheiden. Strangspezifische Sequenzierungstechniken ermöglichen die Identifizierung des spezifischen DNA-Strangs (codierender oder Matrizenstrang), der das RNA-Transkript erzeugt. Darüber hinaus verbessern sie die Genauigkeit der Genexpressionsdaten, indem sie die Annotation der Sequenzierungs-Reads optimieren und die Hinzufügung von übereinstimmenden Sequenzierungs-Reads erleichtern.

Um die Sensitivität der Sequenzierung zu erhöhen, wird rRNA, die 80-90 % der gesamten RNA ausmacht, typischerweise durch Debiasing entfernt. Die Eliminierung von rRNA-Transkripten ermöglicht eine höhere Konzentration von Sequenzierungsreads auf den gewünschten Transkripten, wodurch die Sensitivität des Sequenzierungsprozesses erhöht wird. Die Entfernung von rRNA ist besonders entscheidend, wenn das Expressionsniveau des Zieltranskripts niedrig ist.

mRNA-Sequenzierung

mRNA-Seq ist die bevorzugte Wahl, wenn der Fokus auf dem Kodierungsbereich eukaryotischer Ziele liegt. Diese Methode verwendet eine Screening-Technik, um poly(adenylierte) (poly(A)) RNAs anzureichern. Da mRNAs nur einen kleinen Teil der gesamten RNA ausmachen, erweist sich das Sequenzieren nur der mRNAs als der effizienteste und kostengünstigste Ansatz, wenn es mit dem experimentellen Ziel übereinstimmt.

Im Gegensatz zum rRNA-Entfernungsschritt in der totalen RNA-Seq basiert mRNA-Seq auf der Poly(A)-Affinitätsselektion, um mRNA anzureichern. Beide Methoden entfernen rRNA effektiv aus den Proben. Die Entscheidung zwischen rRNA-Entfernung und Poly(A)-Anreicherung hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Probenmenge und -art (z. B. Prokaryoten, Tiere und Pflanzen), wobei jede unterschiedliche Methoden erfordert.

Beispielanreicherungs- oder Entfernungsverfahren, wie die Ribosomenentfernung oder die mRNA-Anreicherung, verbessern die Qualität der Sequenzierungsdaten sowohl in Total RNA-Seq- als auch in mRNA-Seq-Workflows. Diese Ansätze ermöglichen die Sequenzierung von Ziel-RNA-Molekülen, während der Verlust von Sequenzierungsreads minimiert wird.

Es ist entscheidend, die gewünschten Informationen aus den RNA-Seq-Daten zu identifizieren, da dies hilft, andere RNA-Typen vom Sequenzierungsprozess auszuschließen. Wenn der Fokus auf dem kodierenden Bereich liegt, ist mRNA-Seq die geeignete Wahl. Die Konzentration auf mRNAs liefert überlegene Genexpressionsdaten, da sie nur 3-7 % des Säugetier-Transkriptoms ausmachen. Im Vergleich zu total RNA-Seq ermöglicht mRNA-Seq die Bibliotheksvorbereitung mit kleineren Probenmengen und erhöht gleichzeitig die Sequenzierungstiefe.

mRNA-seq Flussdiagramm und Datenanalyse-Pipeline. (Zhao et al. 2016)

Budgetüberlegungen sind ebenfalls wichtig bei der Auswahl der geeigneten Methode. Total RNA-Seq erfordert mehr Sequenzierungsdaten (typischerweise 100-200 Millionen Sequenzierungsreads pro Probe) und verursacht höhere Kosten im Vergleich zu mRNA-Seq. Wenn nur mRNA-Informationen benötigt werden, bietet mRNA-Seq eine größere Sequenzierungstiefe und niedrigere Kosten als Total RNA-Seq. Dies liegt daran, dass die Sequenzierungsreads (typischerweise 25-50 Millionen Sequenzierungsreads pro Probe) auf Poly(A)-angereicherte RNA-Moleküle konzentriert sind. Für Proben mit begrenztem Ausgangsmaterial ist mRNA-Seq die am besten geeignete Methode, da sie bessere Sequenzierungsread-Daten, niedrigere Kosten und weniger Ausgangsmaterial benötigt.

Wie man mRNA-Sequenzierung und totale RNA-Sequenzierung auswählt

Die Wahl zwischen Total RNA-Seq und mRNA-Seq-Techniken erfordert eine sorgfältige Abwägung des übergeordneten experimentellen Ziels, potenzieller biologischer Probleme und technischer Einschränkungen. Jede Methode bietet einzigartige Vor- und Nachteile. Total RNA-Seq ermöglicht die umfassendste Analyse des Transkriptoms, indem sie alle im Sample vorhandenen RNA-Spezies erfasst, einschließlich nicht-kodierender RNAs und Varianten des alternativen Spleißens. Im Gegensatz dazu konzentriert sich mRNA-Seq speziell auf protein-kodierende Transkripte und liefert überlegene Daten zu den kodierenden Regionen der Gene.

Neben dem experimentellen Ziel sollten mehrere andere Faktoren berücksichtigt werden. Der Probentyp spielt eine entscheidende Rolle bei der Auswahl der geeigneten Methode. Bei Proben mit begrenztem Ausgangsmaterial, wie kleinen Gewebeproben oder Einzelzellen, wird häufig mRNA-Seq bevorzugt, da es eine höhere Sensitivität aufweist und mit geringen Eingabemengen arbeiten kann. Total RNA-Seq hingegen ist vielseitiger und kann ein breiteres Spektrum an Probentypen verarbeiten, einschließlich degradierter oder teilweise fragmentierter RNA.

Das Ausgangsvolumen der Probe sollte ebenfalls berücksichtigt werden. Wenn das verfügbare Ausgangsmaterial begrenzt ist, könnte mRNA-Seq eine praktikablere Option sein. Umgekehrt kann, wenn ein größeres Volumen an Ausgangsmaterial zur Verfügung steht, das totale RNA-Seq effizienter durchgeführt werden.

Das Projektbudget ist ein weiterer wichtiger Faktor. mRNA-Seq ist im Allgemeinen kostengünstiger, da es sich auf einen kleineren Teil des Transkriptoms konzentriert, während das gesamte RNA-Seq das gesamte Transkriptom abdeckt und möglicherweise ein größeres Budget erfordert.

Darüber hinaus ist es entscheidend, die technischen Einschränkungen und Anforderungen jeder Methode zu bewerten. mRNA-Seq umfasst zusätzliche Schritte zur Anreicherung von mRNA, die Verzerrungen einführen können. Auf der anderen Seite, total RNA-Seq erfasst die gesamte RNA-Population, könnte jedoch eine geringere Spezifität für mRNA aufweisen. Berücksichtigen Sie das verfügbare Fachwissen und die Ressourcen im Labor für die Durchführung der gewählten Methode.

Durch die Berücksichtigung des experimentellen Ziels, potenzieller biologischer Probleme, technischer Einschränkungen, des Proben Typs, des Ausgangsvolumens der Probe und des Projektbudgets können Sie eine informierte Entscheidung treffen, ob Sie für Ihre spezifischen Forschungsbedürfnisse Total RNA-Seq oder mRNA-Seq verwenden sollten. Es ist auch ratsam, Rat von Experten oder Bioinformatikern einzuholen, um sicherzustellen, dass die geeignetste Methode gewählt wird.

Referenzen:

1. Cui, Lian, et al. "RNA-Modifikationen: Bedeutung in der Biologie von Immunzellen und verwandten Krankheiten." Signaltransduktion und gezielte Therapie 7.1 (2022): 334.
2. Zhao, Shanrong, et al. "Bioinformatik für die Analyse von RNA-seq-Daten." Bioinformatik – Aktualisierte Funktionen und Anwendungen: InTech (2016): 125-49.