Umfassender Überblick über die mRNA-Sequenzierung

In den letzten Jahren hat der rasante Fortschritt in der Biotechnologie die Bedeutung der Gen-Sequenzierungstechnologie in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis exponentiell hervorgehoben. Besonders hervorzuheben ist, mRNA-Sequenzierung Technologie hat sich als ein essentielles Werkzeug in wichtigen Bereichen wie dem Erstellen von Genexpressionsprofilen und der Durchführung von transkriptomische Studien, Mutationen zu identifizieren und die Funktionalität von Genen zu überprüfen, was bemerkenswerte Erfolge verzeichnet hat. Ziel dieses Papiers ist es, eine detaillierte Erkundung der technischen Prinzipien der mRNA-Sequenzierung und ihrer Anwendung in verschiedenen Bereichen zu bieten.

mRNA-seq Technologieprinzipien

mRNA-Sequenzierung stellt eine Methode dar, die die Fähigkeiten von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien nutzt, um RNA-Moleküle quantitativ zu analysieren. Diese Methodik umfasst eine Reihe von entscheidenden Schritten wie RNA-Extraktion, RNA-Isolierung und -Reinigung, die Synthese von komplementärer DNA (cDNA), den Aufbau von Bibliotheken und schließlich die Hochdurchsatz-Sequenzierung. Jede der genannten Phasen erfordert eine eingehende Diskussion.

RNA-ExtraktionZunächst wird die gesamte RNA, einschließlich mRNA und nicht-kodierender RNA, aus der Probe extrahiert. Die Qualität dieser extrahierten Gesamt-RNA ist entscheidend für den Erfolg der nachfolgenden Experimente, weshalb die Verwendung eines hochwertigen RNA-Extraktionskits und die strikte Einhaltung der bereitgestellten Anweisungen erforderlich sind.

RNA-Trennung und -ReinigungDie gesamte extrahierte RNA-Probe könnte wahrscheinlich mit großen Mengen an nicht-kodierender RNA, wie rRNA, kontaminiert sein. Das Vorhandensein solcher nicht-kodierender RNA kann nachfolgende Analysen stören. mRNA-Sequenzierung Analysen. Daher ist es unerlässlich, um die Genauigkeit der mRNA-Sequenzierung sicherzustellen, mRNA effektiv vom gesamten RNA zu trennen und zu reinigen. Zu den gängigen Laborverfahren zur Trennung und Reinigung gehören die Oligo(dT)-Anreicherung und die Isolation mit magnetischen Perlen.

Angesichts der erheblichen strukturellen Unterschiede zwischen mRNA in Eukaryoten und Prokaryoten, insbesondere der einzigartigen Poly(A)-Schwanzstruktur am 3'-Ende der eukaryotischen mRNA, können wir dieses Merkmal zur spezifischen Isolation von mRNA nutzen. Durch die Verwendung von magnetischen Perlen, die Oligo(dT) tragen, können wir ihre selektive Bindungsfähigkeit an die Poly(A)-Schwanzstruktur der mRNA ausnutzen und so nicht-zielgerichtete RNA aus der Gesamt-RNA eliminieren. Nach spezifischen Elutionsschritten kann die gebundene mRNA dann von den magnetischen Perlen eluiert werden. Schließlich wird die mRNA einer Fragmentierung unterzogen, wobei ein Reagenz mit Magnesiumionen verwendet wird, um die Anforderungen für die anschließende Sequenzierung zu erfüllen.

cDNA-SyntheseSobald die mRNA getrennt und gereinigt ist, kann sie einer reversen Transkription unterzogen werden, um entsprechendes cDNA zu synthetisieren. Während der cDNA-Synthese kann je nach Anforderung entweder die Tailing-Methode oder die Random-Primer-Methode ausgewählt werden. cDNA, die mit der Tailing-Methode synthetisiert wurde, bietet längere Leselängen, was die nachgelagerte Analyse erleichtert, während die Random-Primer-Methode eine umfassende Abdeckung des Genoms unabhängig von relativ kürzeren Leselängen erreichen kann.

BibliotheksbauVor der Hochdurchsatz-Sequenzierung muss das erzeugte cDNA in eine entsprechende Bibliothek strukturiert werden. Während dieses Verfahrens muss cDNA einer Fragmentierung und der Hinzufügung von Sequenzierungsadaptern unterzogen werden. Zu den prominenten Methoden zur Bibliothekskonstruktion, die in der Industrie durchgeführt werden, gehören Illumina-Bibliothekskonstruktion und Ion Torrent Bibliothekskonstruktion. Diese Methoden können die cDNA-Bibliothekskonstruktion effizient und genau abschließen und bieten somit eine zuverlässige Grundlage für die anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung.

mRNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitungs Schritte.

Hochdurchsatz-SequenzierungSequenzierungsdaten werden in großen Mengen erzeugt, wenn die vorbereiteten Bibliotheken auf Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattformen betrieben werden. Derzeit gehören zu den verbreiteten Sequenzierungsplattformen Illumina, Ion Torrent und PacBio.

Breite Anwendung der mRNA-Sequenzierungstechnologie

Messenger-RNA-Sequenzierung (mRNA-seq) stellt eine hochdurchsatzfähige und empfindliche Methode zur Analyse der Genexpression dar, die sowohl in der wissenschaftlichen Forschung als auch in klinischen Anwendungen bedeutende Erfolge erzielt hat. Mit dem fortschreitenden Fortschritt der Sequenzierungstechnologien wird der entscheidenden Rolle von mRNA-seq in zukünftigen Anwendungen zunehmend mehr Bedeutung beigemessen. Dennoch gibt es bestimmte Einschränkungen der mRNA-seq-Methodik, wie komplexe Probenverarbeitung und mühsame Datenanalyse, die eine Optimierung in praktischen Anwendungen erfordern.

Genexpressionsmuster

mRNA-Seq ist zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Muster der Genexpression und deren regulatorische Mechanismen aufzudecken. Durch die präzise Erfassung von Genexpressionsprofilen in verschiedenen Geweben, Entwicklungsstadien und pathologischen Bedingungen können wir differenziell exprimierte Gene genau identifizieren und ihre zentrale Rolle in biologischen Prozessen vermuten. Diese Technik ermöglicht zudem eine eingehende Erkundung komplexer Bereiche wie Splice-Isoformen und nicht-kodierende RNA, wodurch sie eine solide Unterstützung für ein umfassendes Verständnis der Genfunktion bietet.

Krankheitsmechanistische Forschung

Aus der Perspektive der mechanistischen Forschung zu Krankheiten bietet mRNA-seq Wissenschaftlern einen einzigartigen Untersuchungsansatz. Durch die Durchführung vergleichender Analysen von Genexpressionsprofilen zwischen Fall- und Kontrollgruppen können wir differenziell exprimierte Gene genau identifizieren, die stark mit Krankheiten korreliert sind. Eine weitere Untersuchung der Funktionen und regulatorischen Netzwerke dieser Gene kann tiefere Einblicke in die Krankheitsentstehung und -progression ermöglichen und neue Erkenntnisse für Diagnose und Behandlung bieten.

Arzneimittelentwicklung

Im Bereich der Arzneimittelentwicklung spielt mRNA-seq eine ebenso unverzichtbare Rolle. Durch den Vergleich der Genexpressionsprofile der mit dem Medikament behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe können wir differentielle exprimierte Gene identifizieren, die eng mit den Arzneimittelzielen verbunden sind. Eine weitere Analyse der Funktionalitäten und regulatorischen Mechanismen dieser Gene hilft uns, neuartige therapeutische Ziele zu identifizieren, und bietet somit innovative Strategien für die Arzneimittelforschung und -entwicklung.

Biologische Forschung

(1) GenexpressionsanalyseDurch mRNA-Sequenzierung können wir untersuchen, wie Gene sich in verschiedenen Geweben, Entwicklungsstadien und Umweltbedingungen ausdrücken. Diese Technik liefert Informationen über die Expressionsprofile von Genen, wobei der Vergleich verschiedener Proben die Identifizierung von Genen ermöglicht, die eine Schlüsselrolle in spezifischen biologischen Prozessen spielen, und darüber hinaus regulatorische Netzwerke zwischen Genen aufdeckt.

(2) MutationsnachweismRNA-Sequenzierung kann Variationen in Gensequenzen erkennen, einschließlich einzelner Nukleotidvariationen (SNVs) sowie Insertionen und Deletionen (Indels). Solche Mutationen können das Phänotyp eines Organismus drastisch beeinflussen und stehen oft in engem Zusammenhang mit den Mechanismen genetischer Erkrankungen, krebserregenden Mutationen und individuellen genetischen Unterschieden.

(3) Transkriptom-AssemblierungmRNA-Sequenzierung ermöglicht es uns nicht nur, spezifische Gene zu identifizieren, sondern auch Transkripte zusammenzustellen. Ein Gen kann mehrere unterschiedliche Transkriptvarianten aufweisen, von denen jede potenziell unterschiedliche Funktionen oder regulatorische Rollen ausübt. Durch die Bestimmung dieser Varianten können wir eine tiefere Untersuchung der Gen-Spleißung und der Mechanismen der transkriptionalen Regulation durchführen.

(4) Analyse der TranskriptomdynamikDurch die kontinuierliche Sequenzierung von Proben zu verschiedenen Zeitpunkten können wir die dynamischen Veränderungen der Genexpression aufdecken. Diese Technik ist von großer Bedeutung für die biologische Entwicklung, die zelluläre Signaltransduktion und die Forschung zum Krankheitsverlauf. Sie hilft uns, das Wachstum, die Entwicklung und die Krankheitsentstehung von Organismen besser zu verstehen und bietet theoretische Unterstützung sowie praktische Leitlinien für die Behandlung und Prävention von Krankheiten.

Vorteile der mRNA-Sequenzierung

Mit dem rasanten Fortschritt in biologischen Technologien hat sich die Genexpressionsanalyse als einer der Schwerpunkte der zeitgenössischen biologischen Forschung herauskristallisiert. Traditionelle Genexpressions-Mikroarrays und die aufkommende mRNA-Seq-Technologie stellen gängige Methoden zur Analyse der Genexpression dar; jedoch weist mRNA-Seq in verschiedenen Aspekten deutliche Vorteile gegenüber letzterer auf. Mit dem fortschreitenden technologischen Fortschritt und der Kostensenkung wird prognostiziert, dass mRNA-Seq ein zunehmend lebendiges Bild der biologischen Welt zeichnen wird.

Primär bietet mRNA-Seq eine breitere Anwendbarkeit in Bezug auf den dynamischen Bereich im Vergleich zu Genexpressions-Mikroarrays. Letztere sind aufgrund ihres Designs durch ihre inhärente Unflexibilität eingeschränkt, was die genaue Messung von Genexpressionsniveaus mit niedriger Häufigkeit erschwert. Im Gegensatz dazu kann mRNA-Seq extrem niedrige Genexpressionsniveaus nachweisen, wodurch die Sensitivität erheblich erhöht wird. Gleichzeitig ermöglicht mRNA-Seq, da es quantitative Sequenzierungstechniken verwendet, eine genauere Messung von Faltänderungen in der Genexpression und bietet den Forschern zuverlässigere Daten.

Zweitens kann mRNA-Seq gleichzeitig bekannte und neuartige Merkmale erfassen. Traditionelle Genexpressions-Mikroarrays sind auf die Entwurfskapazität bekannter Gensequenzen beschränkt und können neuartige Transkripte oder Genvarianten nicht nachweisen. Im Gegensatz dazu kann mRNA-Seq das gesamte Transkriptom vollständig abdecken und ist nicht durch bekannte Gensequenzen eingeschränkt, was die Erkennung neuer Transkripte, Spleißvarianten und Genfusionen ermöglicht. Diese umfassende Abdeckung verleiht mRNA-Seq eine größere Flexibilität und Vollständigkeit bei der Analyse komplexer Transkriptome.

Darüber hinaus ist mRNA-Seq auf eine Vielzahl von Arten anwendbar. Genexpressions-Mikroarray erfordern eine Gestaltung gemäß den spezifischen Gensequenzen der jeweiligen Arten, was ihren Anwendungsbereich einschränkt. Im Gegensatz dazu benötigt mRNA-Seq weder vorgefertigte Sonden noch Primer und kann das Transkriptom jeder gegebenen Art direkt sequenzieren. Dieses einzigartige Merkmal hat tiefgreifende Auswirkungen auf interspezifische Vergleiche und die Forschung zur Genfunktion sowie auf andere Bereiche, was seine weitreichenden Perspektiven für zukünftige Anwendungen untermauert.

mRNA-Sequenzierungsdatenanalyse

PCA-DiagrammIm Kontext eines Mehrfachproben-Szenarios haben wir die procmp-Funktion innerhalb der R-Sprache verwendet, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) basierend auf den Expressionsdaten einzelner Proben durchzuführen. Diese Analysemethode nutzt Techniken zur Dimensionsreduktion, die es ermöglichen, ähnliche Proben in einem zweidimensionalen Raum zu gruppieren, wodurch eine visuelle Darstellung der Variabilität innerhalb und zwischen den Probengruppen bereitgestellt wird. In dieser grafischen Darstellung steht die x-Achse für die erste Hauptkomponente, während die y-Achse die zweite Hauptkomponente bezeichnet, was den Forschern ein äußerst intuitives und wissenschaftlich fundiertes Analysewerkzeug bietet.

Hauptkomponentenanalysen (PCA) für RNA-seq-Daten (Leonardo Miguel Galindo Gonzalez et al., 2020)

Volcano-DiagrammDurch sorgfältige Analyse können wir die Ausdrucksmuster differenzieller Gene erkennen, die hauptsächlich durch Genverteilungsdiagramme offenbart werden. Diese grafische Darstellung zeigt nicht nur die Genverteilung, sondern hebt auch die Faltungsänderungen in der Genexpression sowie die Signifikanz der Ergebnisse hervor. Idealerweise sollte die Verbreitung der differenziellen Gene auf beiden Seiten des Diagramms einen relativ symmetrischen Trend aufweisen.

Bei näherer Betrachtung stellen wir fest, dass die Anzahl der roten und blauen Punkte abnimmt, wenn der Unterschied zwischen den beiden Gruppen von Proben minimal ist. Dieses Szenario deutet auf eine geringere Anzahl von differentiellen Genen hin, die potenziell unsere zukünftigen Forschungsrichtungen beeinflussen könnten, was zu einem vergleichsweise begrenzten Auswahlbereich führt.

Innerhalb des Diagramms symbolisieren rote Punkte hochregulierte Gene, grüne Punkte repräsentieren herunterregulierte Gene, während graue Punkte nicht signifikant unterschiedlich exprimierte Gene kennzeichnen. Diese Erkenntnisse bieten uns eine umfassende Perspektive auf die Unterschiede in der Genexpression, wodurch eine tiefere Analyse gefördert und unsere Forschungsbemühungen vorangetrieben werden.

Ruijie Cynthia Liu et al., 2016

Cluster-WärmekarteDie Clusteranalyse dient als eine anspruchsvolle Technik, die darauf abzielt, die Ausdrucksmuster von differentiell exprimierten Genen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu erkennen. Bei diesem Ansatz werden Gene, die eine hohe Korrelation in ihren Ausdrucksniveaus aufweisen, innerhalb derselben Gruppe klassifiziert. Dieses Phänomen deutet typischerweise auf erhebliche Zusammenhänge zwischen diesen Genen in bestimmten biologischen Vorgängen oder speziellen Stoffwechsel- und Signalwegen hin. Daher kann die Clusteranalyse der Genexpression potenziell bedeutende biologische Verbindungen zwischen Genen aufdecken, die noch nicht klar artikuliert wurden. Bei der Präsentation der Ergebnisse werden Gene üblicherweise horizontal dargestellt, wobei jede Spalte eine Probe repräsentiert. Hoch exprimierte Gene werden in Rot gekennzeichnet, während niedrig exprimierte Gene in Grün dargestellt werden. Diese Form der Darstellung trägt zu einem intuitiveren Verständnis von Variationen und Zusammenhängen in der genetischen Expression bei.

Heatmap der differentially exprimierten Gene

Gene-Ontologie / KEGG-Weganreicherung BlasendiagrammDie GO-Anreicherungsanalyse wurde unter Verwendung des Software-Tools topGO durchgeführt. Während dieser Analyse verwendeten wir Annotationen der GO-Begriffe, um die Genliste innerhalb jedes Begriffs und deren jeweilige Mengen zu berechnen, basierend auf unserem differentiellen Gen-Set. Anschließend setzten wir eine statistische Methode der hypergeometrischen Verteilung ein, um den P-Wert jedes Begriffs zu berechnen. Ein gegebener Begriff gilt als signifikant angereichert, wenn der P-Wert kleiner als 0,05 ist. Dieses Verfahren ermöglicht es uns zu bestimmen, welche GO-Begriffe hauptsächlich durch die differentiellen Gene im Verhältnis zum gesamten genomischen Hintergrund angereichert sind, wodurch die wesentlichen biologischen Funktionen, die diese differentiellen Gene ausführen, aufgezeigt werden.

In Verbindung mit den Ergebnissen der KEGG-Anreicherungsanalyse verwenden wir drei Metriken, um das Ausmaß der Anreicherung zu bewerten: Rich-Faktor, Falsche Entdeckungsrate (FDR)-Wert und Anzahl der Gene, die in diesem Weg angereichert sind. Genauer gesagt bezeichnet der Rich-Faktor das Verhältnis der Anzahl der tatsächlich differenziellen Gene, die in einem bestimmten Weg angereichert sind, zur Gesamtanzahl der differenziellen Gene, die in diesem Weg annotiert sind. Ein höherer Wert weist auf einen höheren Grad der Anreicherung hin. Der FDR-Wert liegt normalerweise zwischen 0 und 1: Werte, die näher bei 0 liegen, deuten auf eine signifikante Anreicherung hin. In der Regel entscheiden wir uns dafür, eine eingehende Analyse und grafische Darstellung der wenigen Wege mit dem niedrigsten FDR-Wert und den meisten Genen unter den differenziellen durchzuführen.

Die GO-Begriff- und KEGG-Weganreicherung (Na Wang et al., 2019)

Zusätzliche Anmerkung:

Neben der Erstellung der zuvor erwähnten grafischen Ergebnisse bietet die Transkriptom-Sequenzierung eine Vielzahl von Diagrammtypen, einschließlich KEGG-Wegdiagrammen und PPI-Protein-Netzwerkinteraktionsgrafiken, unter anderem. Benutzer können diese Ressourcen je nach individuellen Forschungsanforderungen auswählen und nutzen.

Sollte der Wissenschaftler bereits Genexpressionsexperimente wie qPCR durchgeführt haben, wäre es vorteilhaft, in nachfolgenden transcriptomischen Forschungen eine umfassende Analyse von Genfamilien oder von auf- und abwärts gerichteten Genen, die mit den in den vorherigen Experimenten beteiligten Signalwegen zusammenhängen, zu priorisieren. Dieser Ansatz verdeutlicht die untersuchten Mechanismen weiter und bereichert somit die Tiefe und Breite des Forschung Inhalts.

Referenzen:

1. Ura, H., Togi, S. & Niida, Y. Ein Vergleich von Methoden zur Vorbereitung von mRNA-Sequenzierungsbibliotheken (RNA-Seq) für die Transkriptomanalyse. BMC Genomik 23, 303 (2022).
2. Ponomarenko EA, Krasnov GS, Kiseleva OI, Kryukova PA, Arzumanian VA, Dolgalev GV, Ilgisonis EV, Lisitsa AV, Poverennaya EV. Anwendbarkeit der mRNA-Sequenzierung zur Vorhersage der Proteinmenge. Gene (Basel). 2023
3. Gunter, H.M., Idrisoglu, S., Singh, S. et al. Qualitätsanalyse von mRNA-Impfstoffen mittels RNA-Sequenzierung. Nat Commun 14, 5663 (2023).