Illumina Bibliotheksvorbereitung

Die Bibliothekskonstruktion umfasst die Vorbereitung von Ziel-RNA oder -DNA zur Kompatibilität mit Sequenzierungsinstrumenten. Zunächst wird DNA oder RNA aus Geweben oder Zellen extrahiert und mithilfe mechanischer oder enzymatischer Methoden fragmentiert. Im Fall von RNA-Proben wird eine reversen Transkription durchgeführt, um RNA in cDNA umzuwandeln, gefolgt von der Ligation von DNA-Fragmenten. Anschließend wird die Bibliothek typischerweise durch PCR amplifiziert, um die gewünschten Zielfragmente zu vervielfältigen, bevor sie für die Sequenzierung bereit ist.

Für die Illumina-Bibliotheksvorbereitung umfasst der Prozess häufig spezifische Schritte, die auf Illumina-Sequenzierung Plattformen. Dies kann die Endreparatur und die Hinzufügung von dA-Basen umfassen, um die anschließende Adapterligation zu erleichtern. Die Methoden zur Konstruktion von Illumina-Bibliotheken beinhalten auch einzigartige Adaptersequenzen, die mit Illumina-Sequenziergeräten kompatibel sind. Die Bibliotheken werden dann einer PCR-Amplifikation unterzogen, um Zielfragmente anzureichern. Letztendlich werden Illumina-Bibliotheken vorbereitet und optimiert, um hochwertige Sequenzierungsdaten auf Illumina-Plattformen zu liefern.

Im Mittelpunkt des Bibliotheksaufbaus steht der Prozess, Verbindungsstellen an die Enden der zu untersuchenden Fragmente anzufügen. Derzeit können die Methoden zur Konstruktion von DNA-Bibliotheken in fünf Kategorien eingeteilt werden, basierend auf den unterschiedlichen Ansätzen zur Verbindung der Junctions.

Workflow der Bibliotheksvorbereitung für Illumina-Plattformen

• Endreparatur und dA-Tailing

Nach der zufälligen Fragmentierung der DNA im vorhergehenden Schritt können die erzeugten DNA-Fragmente unebene Enden aufweisen. Daher konzentriert sich dieser Schritt auf die Modifizierung der Enden dieser DNA-Fragmente. Es beinhaltet das Glätten der Enden und das Anhängen einer charakteristischen A-Base am 3'-Ende, während das 5'-Ende phosphoryliert wird. Das Hauptziel der Hinzufügung der A-Base besteht darin, klebrige Enden zu erzeugen, die die Anheftung von Junction-Primer im nachfolgenden Schritt erleichtern.

• Adapter-Ligation

Ein Adapter dient als kurze Sequenz von Basen, die das zu untersuchende DNA-Fragment mit der Flowcell verbindet. T4 DNA-Ligase wird häufig eingesetzt, um einzelsträngige Einschnitte in doppelsträngiger DNA zu reparieren und die Wiederverbindung benachbarter Nukleotide zu ermöglichen. Im Falle der Ligation kann ein DNA-Fragment mit einem "T" klebrigen Ende mit einem anderen DNA-Fragment mit einem "A" klebrigen Ende verbunden werden, wodurch ein vollständiger Doppelstrang entsteht.

Sobald die TA-Ligation erfolgt, wird die Phosphodiesterbindung zwischen dem Adaptor und dem DNA-Fragment hergestellt. Typischerweise findet die Ligation in einem Puffer statt, der hochkonzentrierte Salzkristalle und PEG enthält. Die hochkonzentrierten Salzkristalle neutralisieren die negative Ladung des Phosphatrückgrats und erleichtern die Aggregation von Nukleinsäuren, während PEG Wassermoleküle vom Nukleinsäurerückgrat aufnimmt und die Aggregation von Nukleinsäuremolekülen fördert. Darüber hinaus erhöht PEG die Viskosität der Lösung, was das Absetzen der Reinigungsperlen unterstützt. Magnetische Perlen können jedoch Herausforderungen beim Absetzen darstellen. Nach der Ligation muss das Produkt gereinigt werden, um Interferenzen mit dem anschließenden PCR-Amplifikationsschritt zu vermeiden.

Schema für die Multiplex-Bibliotheksvorbereitung mit Illumina MiSeq unter Verwendung von taillierten PCR-Primern und der Ligation von einfach indizierten Y-Adaptern. (Bourlat et al., 2016)

• Bibliotheksverstärkung

Illumina Amplicon-Bibliotheksvorbereitung durch 2-Schritt-PCR-Amplifikation. (Holm et al., 2018)

Vergleich der Illumina-Bibliotheksvorbereitungsverfahren: TruSeq DNA vs. Nextera

Illumina bietet zwei Hauptmethoden zur Bibliotheksvorbereitung an: die TruSeq-DNA-Methode (Standardbibliothekskonstruktion) und die Nextera-Bibliothekskonstruktionsmethoden (Transposase-Methode zur Bibliothekskonstruktion), die jeweils unterschiedlichen Bedürfnissen und Vorlieben gerecht werden.

Die TruSeq-DNA-Methode ist bekannt für ihre Komplexität, bietet jedoch mehrere Vorteile. Mit einem erforderlichen Startvolumen von 500 ng für die Bibliothek eignet sie sich für DNA-Proben von niedrigerer Qualität und stellt eine kosteneffektive Lösung mit hoher Genomabdeckung dar. Darüber hinaus optimieren die Automatisierungsfähigkeiten den Prozess und machen sie für allgemeine Genombibliotheken geeignet.

Andererseits wird die Nextera-Bibliothekskonstruktion aufgrund ihrer Einfachheit geschätzt. Obwohl sie DNA von höherer Qualität erfordert, bietet sie Vorteile wie schnellere Abläufe und Flexibilität. Mit einem Ausgangsvolumen von nur 50 ng oder sogar 1 ng ist sie besonders gut für Proben mit begrenztem Volumen geeignet. Allerdings ist sie kostenintensiver und kann im Vergleich zur TruSeq-Methode zu einer geringeren Genomabdeckung führen.

Illumina Standardbibliothekskonstruktion

Die Standardbibliothekskonstruktion von Illumina umfasst überwiegend mechanische Unterbrechungen zur Fragmentgrößenbestimmung, mit Ausnahme der Ampliconkonstruktion. Der Ablauf der Bibliothekszusammenstellung gestaltet sich wie folgt:

• DNA-Fragmente durch ultrasonische Unterbrechung.
• Endreparatur, gefolgt von der Hinzufügung von "A".
• Knotenverbindung.
• Fragment-Screening.
• PCR-Anreicherung von Zielfragmenten, gefolgt von der Qualitätskontrolle.
• Sequenzierung.

Die Transposase-Methode zur Bibliothekskonstruktion

Die Transposase-Methode zur Bibliothekskonstruktion verwendet Transposase, um das Genom zu fragmentieren, und der Prozess verläuft wie folgt:

Transposase zerschneidet die genomische DNA und integriert gleichzeitig die erforderlichen Adapter direkt an die Enden der Fragmente, wodurch die Zeit für den Bibliotheksaufbau verkürzt und der Probenbedarf reduziert wird. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für Anwendungen mit begrenzter Probenverfügbarkeit, wie Tumorbiopsien, degradierte DNA oder gereinigte DNA.

• Anheftung von Junctions an transposase-unterbrochene Fragmente.
• Reinigung von Bibliotheks-DNA-Fragmenten (Entfernung der Transposase).
• Mehrere Zyklen der PCR zur Einfügung von P5-, P7-Junktionen und Indizes.
• Fragment-Screening zur Qualitätskontrolle.
• Sequenzierung.

Illumina DNA PCR-freie Bibliotheksvorbereitung

Im Illumina DNA PCR-freien Prep-Tagmentationsprozess sind die folgenden Schritte beteiligt:

Der Produktname hat sich von Nextera DNA Flex zu Illumina DNA Prep geändert, was seine Abhängigkeit von der On-Bead-Tagmentierungsmethode widerspiegelt.

Dieses innovative Verfahren kombiniert die DNA-Extraktion, Fragmentierung, Bibliotheksvorbereitung und Bibliotheksnormalisierung in einem einzigen optimierten Prozess. Zunächst fragmentieren BLT (Bead-Linked Transposomes) das genomische DNA (gDNA) enzymatisch, während sie gleichzeitig die Sequenzierungsprimer von Illumina anheften. Anschließend wird die fragmentierte gDNA einer PCR-Amplifikation unterzogen, bei der Sequenz-Tags und Verbindungsstellen integriert werden. Danach werden die sequenzierten Fragmente gereinigt, und die Bibliothek wird für die Sequenzierung vorbereitet.

Andere Methoden zur Konstruktion von NGS-Bibliotheken

Die Konstruktion von NGS-Bibliotheken kann in fünf Typen kategorisiert werden, basierend auf den unterschiedlichen Ansätzen zum Verbinden von Zielfragmenten.

• TA-Klonierungs-Ligationsmethode: Diese weit verbreitete Methode ist für die meisten Proben anwendbar und stellt den gängigen kommerziellen Ansatz zur Bibliothekskonstruktion dar.
• Swift-Methode: Ähnlich wie die TA-Klonierungs-Ligation-Methode umfasst die Swift-Methode etwas umständlichere Vorgänge. Besonders bemerkenswert ist, dass die Verbindung der P5- und P7-Adapter in zwei Schritten erfolgt.
• Transposase-Methode: Diese Methode vervollständigt den Bibliotheksaufbau in nur 1 Stunde und 40 Minuten und reduziert somit die Anforderungen an das Personal erheblich. Sie ist jedoch nur für den Aufbau von cDNA- und Ganzgenom-Bibliotheken geeignet. Darüber hinaus zeigt das Transposase-Enzym Präferenzen, die die Sequenzierungsqualität beeinflussen können.
• PCR-Amplicon-Bibliothekskonstruktion: Dieser Ansatz, bekannt als Capture-Bibliothekskonstruktion, ist besonders nützlich für die Erforschung gezielter Gene im klinischen Kontext.
• Flat-End Junction Bibliothek: Speziell für die Ion Torrent-Plattform entwickelt, ist diese Methode in ihrer Anwendung aufgrund des relativ geringen Marktanteils von Ion Torrent eingeschränkt. Daher ist ihre Nutzung relativ begrenzt.

Referenzen:

1. Holm, Johanna B., et al. "Ultra-hochdurchsatz-Multiplexing und Sequenzierung von > 500 bp Amplicon-Regionen auf der Illumina HiSeq 2500 Plattform." bioRxiv (2018): 417618.
2. Bourlat, Sarah J., et al. "Vorbereitung von Amplicon-Bibliotheken für das Metabarcoding von marinen Eukaryoten unter Verwendung von Illumina MiSeq: die Dual-PCR-Methode." Marine Genomik: Methoden und Protokolle (2016): 197-207.