Immunspektrum-Sequenzierung: Einführung, Arbeitsablauf und Anwendungen

Einführung in die Sequenzierung des Immunrepertoires

Das adaptive Immunsystem spielt eine äußerst wichtige Rolle im Kampf gegen infektiöse Erreger und schützt den menschlichen Körper. Die Grundlage des adaptiven Immunsystems beruht grundlegend auf der enormen Vielfalt von T- und B-Zell-Rezeptoren (TCRs und BCRs), die Epitopen aus einer astronomischen Anzahl von verschiedenen exogenen Antigenen und endogenen Wirtsfaktoren erkennen können. Das Immunrepertoire wird als die Sammlung funktionell vielfältiger B- und T-Zellen im Blutkreislaufsystem bezeichnet, was ein entscheidendes Maß für die immunologische Komplexität darstellt.

Die Untersuchung des Immunspektrums ist entscheidend, um die Reaktion der adaptiven Immunität zu verstehen und wirft letztendlich Licht auf die Entdeckung neuer infektiöser Erreger. Sie birgt das unschätzbare Potenzial, bei der Entwicklung von Antikörpern oder Impfstoffen, der klinischen Diagnose, der Behandlung und der Prävention zu helfen.

Die traditionellen Strategien zur Untersuchung des Immunspektrums, zu denen Spectratyping, Sanger-Sequenzierung usw. gehören, sind mühsam, kostspielig und reichen nicht aus, um ein hochauflösendes Bild des Immunspektrums zu erzeugen. NGS bietet einen leistungsstarken Ansatz, der in der Lage ist, das Immunspektrum in einem Hochdurchsatzverfahren zu analysieren. Durch die Bereitstellung enormer Sequenzierungsdaten hat NGS ein beispiellos hochauflösendes Bild des Immunspektrums geschaffen, das großes Potenzial zur Offenlegung dynamischer Veränderungen in klonalen Populationen während der Antigenstimulation bietet.

Immunspektrum-Sequenzierungs-Workflow

Der Arbeitsablauf von Immunrepertoire-Sequenzierung besteht aus sechs Schritten. Der erste Schritt ist die Zellisolierung. Darauf folgt die Reinigung der Vorlage und die Molekülamplifikation. Der nächste Schritt wäre der Aufbau der Ig-seq-Bibliothek und die Sequenzierung. Dies wird gefolgt von der Datenverarbeitung, die das Filtern, die Ausrichtung und das Clustern der Daten umfasst. Schließlich werden die Daten unter Berücksichtigung der Repertoirevielfalt, Dynamik und Klonalität analysiert.

Abbildung 1. Ein Gesamtstudienablauf der Sequenzierung des B-Zell-Immunspektrums. (Pineda, 2019)

Anwendungen der Immune-Repertoire-Sequenzierung

Die Sequenzierung des Immunspektrums wird in folgenden Bereichen angewendet: (1) Antikörperentdeckung und Impfstoffentwicklung, (2) Entdeckung von Biomarkern, (3) Verständnis der Mechanismen der Entwicklung des Immunspektrums, (4) Identifizierung von Immundefizienzen und (5) als klinisches Diagnosetool.

Biomarker für die Krebsdiagnose, Subtypisierung und Prognose

Ein wichtiges Feld der translationalen Forschung und Medizin der TCR/BCR HTS-Sequenzierung ist die Detektion von minimaler Residualerkrankung (MRD) bei lymphatischen hämatologischen Tumoren, einschließlich T-/B-Zell-abgeleiteter Leukämie und Lymphom. Die Sensitivität und prognostische Nutzung von NGS im Vergleich zu traditionellen Techniken wie der Durchflusszytometrie und allelspezifischer PCR wurden seit Beginn dieses Forschungsfeldes wiederholt untersucht.

Umfassende Analyse der reaktiven Immunrepertoires der Darmmikrobiota

Obwohl die Hochdurchsatzanalyse des Immunsystems im Kontext der Interaktion zwischen Wirt und Mikrobiom ein offenes Forschungsgebiet ist, besteht die vielversprechendste Anwendung dieses Ansatzes in der umfassenden Erkennung von reaktiven T- oder B-Zell-Klonotypen gegen die Darmmikrobiota im zirkulierenden Blut oder in den peripheren Geweben der Wirte. Sehr wichtig ist, dass kürzlich gezeigt wurde, dass gesunde erwachsene Menschen eine beträchtliche Menge an zirkulierenden CD4+ T-Zell-Populationen besitzen, die gegen bakterielle Lysate von gastrointestinalen Kommensalen reaktiv sind, mit Frequenzen von 40–500 pro Million totaler CD4+ T-Zellen, abhängig von jeder Bakterienart. Die Mehrheit dieser reaktiven CD4+ T-Zellen gegen die Darmmikrobiota hatte einen Gedächtnisphänotyp mit relativ hoher Expression von Rezeptoren für die Homing zur Mukosa und einem Th17-Marker (CD161) und war weiter in den intestinalen Geweben angereichert.

Die Mikrobiota des Darms als mögliche Quelle für TCR-Kreuzreaktivitäten

Die T-Zell-Kreuzreaktivität ist ein wichtiges Forschungsgebiet in der Systemimmunologie und wahrscheinlich eines der noch nicht vollständig anerkannten Hauptprinzipien einer adaptiven Immunantwort. Im Einklang mit dieser Hypothese und im Gegensatz zu der vorherigen allgemeinen Überzeugung bewies eine elegante Studie mit TCRβ-transgenen Mäusen, dass die überwiegende Mehrheit der negativ selektierten TCRs autoreaktiv ist und mit Kreuzreaktivitäten gegen multiple MHC-Haplotypen ausgestattet ist, während kreuzreaktive TCRs unter den präselektierten TCRs sehr selten sind.

Referenzen:

1. Pineda S, Sigdel TK, Liberto JM, u. a.Charakterisierung des Risikos einer Nierenabstoßung vor und nach der Transplantation durch Sequenzierung des B-Zell-Immunspektrums. Naturkommunikationen2019, 10(1).
2. Liu X, Wu J. Geschichte, Anwendungen und Herausforderungen der Forschung zum Immunspektrum. Zellbiologie und Toxikologie. 2018, 34(6).
3. Rubelt F, Busse CE, Bukhari SA, u. a.Empfehlungen der Gemeinschaft für den Austausch von Sequenzierungsdaten des adaptiven Immunrezeptorrepertoires. Natur Immunologie2017, 18(12).
4. Friedensohn S, Khan TA, Reddy ST. Fortschrittliche Methoden in der Hochdurchsatz-Sequenzierung von Immunrepertoires. Trends in der Biotechnologie2017, 35(3).
5. Robins H. Immunosequenzierung: Anwendungen der tiefen Sequenzierung des Immunspektrums. Aktuelle Meinungen in der Immunologie2013, 25(5).