Richtlinien zur Probenvorbereitung für die Einzelzell-Sequenzierung

Der Standard für hochwertige Zellen zur Sequenzierung

Gesamtzahl der Zellen: > 1×10⁵ Zellen

Die kleine Zellanzahl reicht nicht aus, um eine genaue Qualitätskontrolle durchzuführen, und ungenaue Qualitätskontrollen können leicht zu Problemen mit der Qualität der Sequenzierungsdaten führen.

Zellkonzentration: 700-1200 Zellen/µl

Stellen Sie sicher, dass ein bestimmtes Volumen hochwertiger Zellen in der Maschine verwendet werden kann und dass die Konzentration der Wiederholungszahlen nicht um mehr als ±100 Zellen/µl schwankt.

Zellendurchmesser ≤ 5 µm, Zielzellendurchmesser < 40 µm

Es wird empfohlen, Zellfilter mit einer Porengröße von 40 µm oder weniger zu verwenden, um Zelltrümmer und verklumpte Zellen herauszufiltern, während kleine Zelldurchmesser die Rate der Multizellularität erhöhen und große Zelldurchmesser dazu neigen, blockierte Poren oder eine niedrige Erfassungsrate zu haben.

Zellviabilität ≥85%

Die Zellviabilität ist ein wichtiger Referenzindikator zur Reflexion der RNA-Integrität, da Zellen mit schweren Schäden oder übermäßiger Dissoziation die RNA-Integrität nicht gut widerspiegeln. Daher gilt grundsätzlich: Je höher die Zellviabilität, desto besser.

Suspensionszustand: Verwenden Sie PBS oder Kulturmedium ohne Ca.²⁺, Mg²⁺EDTA zur vollständigen Wiederaufbereitung

Waschen Sie zweimal mit DPBS und 0,04% BSA. Die Zellaufhängung sollte Zellklumpen, übermäßige Zelltrümmer, das Vorhandensein von großen Trümmern oder anderen Verunreinigungen minimieren. Kein Metall Ca.²⁺, Mg²⁺EDTA und andere Substanzen, die die Aktivität der reversen Transkriptase beeinflussen, sind in der Zell-auf-Board-Wiederaufbereitung vorhanden.

Zellendurchmesser ≤ 5 µm, Zielzellendurchmesser < 40 µm

Es wird empfohlen, Zellfilter mit einer Porengröße von 40 µm und darunter zu verwenden, um Zelltrümmer und agglomerierte Zellen herauszufiltern. Kleine Zell Durchmesser erhöhen die Rate der Multizellularität, während große Zell Durchmesser dazu neigen, blockierte Poren oder eine niedrige Auffangeffizienz zu haben.

Entnahme von Gewebeproben

1. Frisches Gewebe: Probenumfang ≥ 0,2 g
2. Durchstochenes Gewebe: mindestens 2 Streifen (Durchmesser ≥ 1,5 mm, Länge 1,5 cm)
3. Sehr kleine Stichprobengröße: bitte technischen Support kontaktierenje nach der Läsion der Probe, der Entnahmemethode und den Versandbedingungen angemessene Ratschläge zu geben.
4. Hinweise zur Entnahme von Gewebeproben

• Konsistente Probenahme: Der Erfassungsstatus der Proben aus den Experimental- und Kontrollgruppen sollte so ähnlich wie möglich sein.
• Genaues Sampling: Entfernen Sie nicht-zielgerichtete Gewebe, wie überschüssiges Fett und Hülle, und waschen Sie, um Blutreste zu entfernen.
• Halten Sie die Probe feucht: Übertragen Sie die Probe so schnell wie möglich nach der Entnahme in eine Gewebeschutzlösung. Proben, die lange Zeit der Luft ausgesetzt sind, sind anfällig für Dehydrierung und den Tod von Zellen an der Geweboberfläche. Bei Geweben mit kleinem Durchmesser kann eine längere Exposition direkt dazu führen, dass die Proben keine ausreichende Einzelzellaufhängung erhalten. Beispiele sind Punktionproben und die Entnahme von Biopsien mit Zangen aus kleineren, körnigen Geweben.
• Vermeiden Sie Beschädigungen: Vermeiden Sie chemische Kontamination und thermische Schäden. Wenn der Einsatz von Lasermessern, elektrischen Messern und anderen Probenentnahmewerkzeugen unvermeidlich ist, sollte der thermisch beschädigte Teil entfernt werden; Biopsieproben sollten am besten in großen Stücken entnommen werden, jedes Mal wenn die Probe geklemmt wird, um Zellschäden und irreversible Auswirkungen auf nachfolgende Experimente zu reduzieren.

Frische Gewebeproben müssen vollständig in einer vorgekühlten Gewebeaufbewahrungslösung bei 2-8°C eingetaucht werden.

Zellprobenvorbereitung

1. PBMC periphere mononukleäre Zellen

• PBMC-Zellen im Blut werden normalerweise durch Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert.
• Wenn die Einzelzellsequenzierung nicht sofort durchgeführt werden kann, können Sie nach der Gewinnung von PBMC in gutem Zustand wählen, sie nach dem Einfrieren zu versenden.

2. Züchtung von Zellen

• Eingemauerte Zellen werden in der Regel durch Verdauung mit 0,25% Trypsin-EDTA-Enzym dissociiert; empfindliche Zelllinien werden mit einer etwas schwächeren Kollagenase behandelt, um die Zellviabilität effektiv sicherzustellen; suspendierte Zellen können direkt durch sanftes Blasen der Zellaufschlämmung gemischt werden. Waschen Sie die Zellen durch Resuspension mit PBS, das 5% FBS oder 0,05% BSA (oder konventionelles Medium) enthält.
• Bei 2-8 °C lagern und innerhalb von 2 Stunden Einzelzellsequenzierung auf dem Gerät durchführen. Für Zellen, die transportiert oder konserviert werden müssen, können sie lyophilisiert werden.

3. Zellgefrierung

• Die Standardisierung des Zellfrierens hat einen großen Einfluss auf die Qualität des Zellfrierens, und das Gradientenkühlverfahren muss strikt eingehalten werden.
• 1×10⁶-10⁷ Zellen werden in 1 ml Lyophilisierungslösung resuspendiert, in externe spiralförmige Lyophilisierungstuben übertragen, die programmiert sind, auf -80 °C abzukühlen, und in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung überführt. Gefrorene Zellen können für Experimente reaktiviert werden, bitte konsultieren Sie unsere technischen Experten für weitere Details.

Organoid-Probenvorbereitung

Organoide werden normalerweise in einem Matrixgel kultiviert, das aus extrazellulärer Matrix besteht und einige Laminine, Kollagen, Wachstumsfaktoren usw. enthält, die bei 4 °C in Flüssigkeit gelöst und bei 37 °C wieder verfestigt werden können, was ein wichtiges Mikroenvironment und Gewebestütze für das Zellwachstum im Raum bietet.

Spezielle Probenvorbereitung

• Zellfragilität: Direkte Nukleation wird empfohlen, um einzeln nukleierte Suspensionen zu erhalten.
  Für empfindliche Gewebe mit Zellen, wie Leberparenchymzellen oder reifen Adipozyten, die anfällig für Risse sind und größere Zellen aufweisen, ist es schwierig, durch enzymatische Verdauung eine Einzelzellaufhängung mit einem hohen Prozentsatz an Zielzellen zu erhalten. Es wird empfohlen, das Gewebe direkt zu nukleieren, um eine Einzel-nukleierte Suspension zu erhalten.
• Hoher Fettgehalt: Nukleation wird empfohlen
  Für Gewebe mit hohem Fettgehalt ist die Lipiddichte niedrig, sodass sie während der Dissoziation und Zentrifugation in schwebendem oder schwebendem Zustand ist und nicht leicht absinkt (außer unreife Adipozyten). Reife Adipozyten werden nach der Zentrifugation und dem Abwerfen des Überstands leicht entfernt und durch ein Sieb gesammelt, während nur einige unreife Adipozyten während der Zentrifugation absinken und auf der Maschine angereichert werden können, jedoch ist der Prozentsatz begrenzt.
• Zell-Heterotypen: Die Aspiration des Zellkerns wird empfohlen, um Einzelzellkern-Suspensionen zu erhalten.
  Für Gewebe mit Zellheterotypen, wie Muskeln, Herz, Gehirn und Nerven, ist der Zelldurchmesser zu groß, um durch den mikrofluidischen Chip zu gelangen, was leicht zu einer Verstopfung der Chip-Pipeline und einem Fehlschlag bei der Mikrotröpfchenbildung führen kann. Daher wird empfohlen, die Kernextraktion zu wählen, um Einzelzellkern-Sequenzierungsdaten zu erhalten.
• Leicht zu degradieren: übermäßiges Waschen vermeiden und keine langen Transportwege.
  Für Proben, die leicht selbst abgebaut werden, wie Bauchspeicheldrüse (selbstsekretierte Enzymflüssigkeit) und Mausdarm (Darm enthält Verdauungsenzyme aus der Nahrung), sollte darauf geachtet werden, übermäßiges Waschen zu vermeiden und sie nicht über lange Strecken zu transportieren. Sie sollten so schnell wie möglich im Gerät verdaut werden.
• Stark geschädigtes oder erkranktes Gewebe: umgebendes Gewebe zum Schutz enthalten
  Sowohl die Bedürfnisse des Subjekts zu berücksichtigen als auch sicherzustellen, dass das Gewebe in gutem Zustand ist (z. B. stark beschädigte oder erkrankte Zielgewebe, erfordert die Probenahme oft ein größeres Gewebevolumen, einschließlich des umgebenden Gewebes zum Schutz).
• Nicht-Modell-Tierproben
  Neben konventionellen Arten wie Menschen, Affen, Mäusen, Ratten und anderen Säugetieren wird die Einzelzell-Sequenzierung auch häufig bei Süßwasserorganismen, Meereslebewesen, Reptilien, Amphibien, Vogelarten, Insekten, Pflanzen usw. eingesetzt (z. B. Zebrafische, Quallen, Schlangen, Frösche, Vögel, Fruchtfliegen, Parasiten, Hydren, Arabidopsis, Nutzpflanzen, geschützte Pflanzen). Viele Arten müssen entsprechend den Eigenschaften der Art und ihrer Umgebung entnommen, konserviert und transportiert werden. Die Bedingungen für die Konservierung und den Transport richten sich nach den Eigenschaften der Art und ihrer Umgebung.

Zellsortierung

Fließsortierung

Die Flusszellensortierung verwendet Fluorescein, um verschiedene Moleküle zu kennzeichnen, und unterscheidet Zielzellen von Nicht-Zielzellen, indem die geeignete Spannung, Kompensation usw. angepasst wird. Im Bereich des Einzelzell-Sequenzierens kann die Fluss-Sortierung spezifische Zellpopulationen unterscheiden und die Qualitätsoptimierung von Einzelzelldispersionen ermöglichen, was gezieltere und genauere Studien erlaubt.

1. Vor der Sortierung wird empfohlen, eine Voruntersuchung durchzuführen, um den Gehaltsanteil der Zielzellen zu verstehen, um die Sortierbedingungen des Durchflusszytometers zu optimieren.
2. Sortierzeit: Je nach Toleranz der zu sortierenden Zellen wird empfohlen, die Sortierung innerhalb einer Stunde abzuschließen, um die Zellviabilität sicherzustellen.
3. Zellensammellösung: 1 x DPBS (oder Medium), 0,04% BSA / 5% FBS.
4. Für fluss-sortierte Zellen sollte das Prinzip der nicht wesentlichen, nicht gefrierenden Elemente beachtet werden.

Immunomagnetische Beadsortierung

Die immunomagnetische Zellseparation wird durchgeführt, indem spezifische Antikörper, die an Zelloberflächenantigene binden können, an magnetischen Perlen befestigt werden. Je nach Unterschied der markierten Zellen wird die magnetische Perlenseparation normalerweise in zwei Kategorien unterteilt: positive Sortierung und negative Sortierung.

1. Bei der Sortierung mit magnetischen Perlen sind die Unterscheidung und Auswahl von positiven und negativen Sortierkits besonders wichtig, und es sollte auf die Zuverlässigkeit der Sortierreagenzien und die Sortiereffizienz geachtet werden.
2. Vorversuche zur Schätzung des Anteils der Zielzellen zur Erleichterung der formalen Probenvorbereitung.
Die seltene Zellsortierung kann mit der kompositen Sortiermethode ausgewählt werden, die hauptsächlich für die Sortierung von Zellsubpopulationen oder die Trennung von Zellen mit hoher Reinheit verwendet wird.
4. Nach dem Sortieren können die Zellen leicht agglomeriert werden, daher sollte eine Hochgeschwindigkeitszentrifugenanreicherung vermieden werden.

Sortierüberlegungen

1. Lyse von Erythrozyten: Wenn im Originalproben sichtbare rote Ausfällungen mit bloßem Auge zu erkennen sind, sollten die roten Zellen zuerst aufgeschlossen werden, wobei jedoch auf die Zeit der Aufspaltung geachtet werden muss, um Schäden an anderen Zellen zu vermeiden.
2. Zählkorrektur: Der Zellzählwert der Flusszytometrie kann höher sein als die tatsächliche Zellanzahl (20-80 %), was Zähler oder Mikroskopie zur Zählkorrektur erforderlich macht.
3. Zellernte: Es wird empfohlen, dass die Zentrifugationsgeschwindigkeit bei 500 g liegt. Mehr als 500 g kann leicht zu einer Zellresuspension oder -klumpung führen. Wenn Sie sich um die Zellernte sorgen, können Sie die Zentrifugationszeit verlängern.