Übersicht über die Nanopore-Sequenzierungstechnologie

Zusammenfassung

Gene kodieren die gesamte Erbinfo eines Organismus, und Sequenzierung ist der Prozess, bei dem chemische Signale von DNA in digital verarbeitbare Signale umgewandelt werden, was die Sequenzierung in der Genomforschung unverzichtbar macht. Das Aufkommen von Sanger-Sequenzierung (Erstgeneration-Sequenzierung) trieb die Verwirklichung des Human Genome Project voran und markierte bedeutende Fortschritte in der Genomsequenzierungstechnologie in den letzten Jahrzehnten. Der kontinuierliche Fortschritt der Next-Generation-Sequenzierung haben (NGS) Technologien zu einer schrittweisen Senkung der Kosten für genomische Sequenzierung geführt, begleitet von einer Erhöhung des Sequenzdurchsatzes und der Genauigkeit, was die Analyse der Genomstruktur und das Studium genetischer Variation erleichtert und somit die genomische Forschung erheblich vorantreibt. Allerdings hindern bei NGS-Sequenzierungen die durch PCR-Amplifikation während der Bibliothekskonstruktion eingeführten Fehler und die typischerweise kurzen Sequenzleselängen (häufig weniger als 500 bp) die Technologie häufig daran, die höheren Anforderungen einiger moderner biologischer Fragestellungen zu erfüllen. Beispielsweise treten Herausforderungen bei der Bestimmung längerer repetitiver Segmente auf DNA und bei der Bewertung von DNA/RNA-Methylierungsmodifikationen auf. Folglich adressieren die aufkommenden Sequenzierungstechnologien der dritten Generation, wie die Nanopore-Sequenzierung, diese Einschränkungen. Die Nanopore-Sequenzierung ermöglicht die Bestimmung längerer Leselängen (bis zu 10 kbp) ohne die Notwendigkeit komplexer Bibliothekskonstruktionsprozesse. In den letzten Jahren, Nanoporen-Sequenzierung hat in der wissenschaftlichen Gemeinschaft große Aufmerksamkeit erregt.

Überblick über die Nanoporen-Sequenzierung

Was ist die Nanoporen-Sequenzierung?

Die Sequenzierung umfasst hauptsächlich die Identifizierung der vier Nukleotidbasen in der DNA. Aufgrund der auffälligen chemischen Ähnlichkeiten zwischen Purin- und Pyrimidinbasen stellt ihre Unterscheidung erhebliche Herausforderungen dar. Derzeit wird das Vorhandensein der vier Basen hauptsächlich in Signale wie Licht-, elektrische oder pH-Signale umgewandelt, und Unterschiede in der Signalverstärkung werden genutzt, um die verschiedenen Basen zu identifizieren. Nanoporen-Sequenzierung, wandelt jedoch die vier Basen direkt in elektrische Signale um, die eine Identifizierung durch Variationen in Stromsignalen und Wellenformmustern ermöglichen. Darüber hinaus unterscheidet sich das Nanoporen-Sequencing von traditionellen ersten und NGS-Techniken, die eine gleichzeitige Synthese und Sequenzierung beinhalten. Das Nanoporen-Sequencing sequenziert direkt einzelne Moleküle, wodurch die Notwendigkeit einer PCR-Amplifikation während der Sequenzierung entfällt und systematische Fehler, die aus PCR-Bias resultieren, effektiv gemindert werden. Ursprünglich in den 1980er Jahren entwickelt, hat sich das Nanoporen-Sequencing kontinuierlich mit der Entwicklung von Nanoporenproteinen und Motorproteinen weiterentwickelt, was letztendlich zu seiner Realisierung führte.

Meilensteine in der Nanoporen-DNA-Sequenzierung (David et al., 2016)

2. Wie funktioniert die Nanoporen-Sequenzierung?

Das Funktionsprinzip der Nanoporen-Sequenzierung

In Nanoporen-SequenzierungNanopore-Proteine sind auf einer polymeren Membran immobilisiert und in eine Elektrolytlösung eingetaucht, wobei nur die Nanoporen auf der Membran den Ionen den Durchgang ermöglichen. Durch Anlegen einer stabilen Potentialdifferenz über die Nanoporen mithilfe einer externen Stromquelle gelangen Elektrolyt-Ionen durch die Nanoporen, was einen elektrischen Strom über die Membran erzeugt. Gesteuert von Motorproteinen werden Doppelstrang-DNA (dsDNA)-Moleküle (oder RNA-DNA-Hybrid-Duplexe) zunächst entwindet, wodurch einzelsträngige DNA oder RNA durch die Nanopore von der negativen (cis) zur positiven (trans) Seite transloziert werden kann. Aufgrund der unterschiedlichen Volumina und Ladungseigenschaften der Nukleotide verursacht ihr Durchgang durch die Nanopore ausgeprägte Änderungen des elektrischen Stroms über die Membran, was die Identifizierung und Sequenzierung von DNA-Sequenzen ermöglicht.

Das erste entdeckte Nanoporenprotein, das Ionströme beeinflusst und deren Detektion über DNA oder RNA ermöglicht, war α-Hämolysin, ein Membranprotein, das von S. aureus stammt. Ein weiteres häufig verwendetes Nanoporenprotein ist MspA, mit Porendurchmessern von etwa 1-2 nm. In Abwesenheit von Nanoporenproteinen erfolgt die DNA-Translokation jedoch zu schnell, um aussagekräftige elektrische Stromsignale zu erhalten, was die Einführung von Motorproteinen erforderlich macht, um die Rate der DNA-Translokation zu steuern. Im Jahr 2012 fanden Forscher heraus, dass die phi29 DNA-Polymerase, wenn sie als Motorprotein in Verbindung mit den oben genannten Nanoporenproteinen eingesetzt wird, die DNA-Translokation effektiv reguliert und klare, hochauflösende Signale liefert.

Prinzip des Nanoporen-Sequenzierens (Wang et al., 2021)

Der Arbeitsablauf der Nanoporen-Sequenzierung

DNA-ExtraktionExtraktion von DNA oder RNA aus Organismen oder Geweben, gefolgt von der Reinigung.

BibliotheksbauDie Endreparatur und Adapterligierung werden an DNA oder RNA durchgeführt. Diese Adaptersequenzen enthalten spezifische Sequenzen, die mit dem Nanopore-Protein des Nanopore-Sequenzierungsgeräts interagieren, wodurch die Moleküle präzise durch den Nanopore geleitet werden können. Anschließend werden Qualitätskontrolle und Fragmentgrößenauswahl durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Größen- und Qualitätsverteilung der Moleküle in der Bibliothek den Anforderungen entspricht.

Laden und SequenzierungDie konstruierte Bibliothek wird in das Nanoporen-Sequenzierungsgerät geladen, um sequenziert zu werden. Innerhalb des Geräts werden Moleküle durch die Nanopore geleitet, und DNA- oder RNA-Sequenzen werden sequenziert, indem Änderungen im elektrischen Strom überwacht werden.

Bibliotheksvorbereitungsworkflow für Oxford Nanopore Technologies (ONT) (Wang et al., 2021)

3. Leistungsstarke Anwendungen der Nanoporen-Sequenzierung

Die Anwendung in der Genomsequenzierung

Die Nutzung von Nanoporen-Sequenzierungstechnologie Die Genomsequenzierung ist umfangreich. Sie kann eingesetzt werden, um bestehende Referenzgenome zu verbessern, wobei das menschliche Referenzgenom ein herausragendes Beispiel ist. Derzeit hat die Nanoporen-Sequenzierung 12 Lücken (>50 kb jeweils) im menschlichen Referenzgenom geschlossen, einschließlich Sequenzen von telomerischen Wiederholungen und Zentromeren des Y-Chromosoms. Neben dem menschlichen Genom können auch die Referenzgenome anderer Arten mithilfe der Nanoporen-Sequenzierung erweitert und verfeinert werden. Durch die präzise Identifizierung repetitiver Regionen wurde beispielsweise das Referenzgenom von Caenorhabditis elegans um über 2 Mb erweitert. Die Nanoporen-Sequenzierung wurde auch genutzt, um nicht-referenzierten Genome zu lesen, die zuvor nicht berichtet wurden, wie die Zusammenstellung des ersten Genoms von Rhizoctonia solani mithilfe von Nanoporen-Sequenzierungsdaten. Für RNA-Viren kann ONT ebenfalls Sequenzen, wie das Zika-Virus, das Influenza-Virus und andere, erstellen. Während der COVID-19-Pandemie half ONT, das vollständige virale Genom von SARS-CoV-2 schnell durch cDNA-Sequenzierung und direkte RNA-Sequenzierung zu bestimmen, was bedeutende Beiträge zu den anschließenden Impfstoffentwicklungsbemühungen leistete.

Die Anwendung in der Epigenetik

Die Rolle von Nanoporen-Sequenzierung In der epigenetischen Forschung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Unabhängige Studien bereits im Jahr 2013 zeigten die Fähigkeit, methyliertes Cytosin (5mC und 5hmC) in DNA mithilfe charakteristischer Stromsignale in der MspA-Nanoporen-Sequenzierung zu unterscheiden. Anschließend ermöglichte die Entwicklung bioinformatischer Werkzeuge die Identifizierung von drei DNA-Modifikationen (6mA, 5mC und 5hmC) aus ONT-Daten. Methoden wie MeSMLR-seq und SMAC-seq, die ONT-Sequenzierung mit exogener Methyltransferase-Behandlung kombinieren, wurden entwickelt, um die Nucleosomenbesetzung und Chromatinzugänglichkeit zu kartieren. Darüber hinaus ermöglicht die ONT-Sequenzierung die gleichzeitige Charakterisierung verschiedener epigenetischer Merkmale auf einzelnen langen menschlichen DNA-Molekülen, einschließlich des endogenen 5mC-Methyloms und der Nucleosomenbesetzung. Experimentelle Ansätze wie DiMeLo-seq und BIND&MODIFY integrieren ebenfalls die ONT-Sequenzierung mit verschiedenen biochemischen Techniken, um Histonmodifikationen, Histonvarianten und spezifische Protein-DNA-Interaktionen zu kartieren.

Die Anwendung in der Krebsforschung

Nanoporen-Sequenzierung ist integraler Bestandteil der Krebsforschung und umfasst verschiedene Krebsarten wie Leukämie, Brustkrebs, Gehirntumoren, kolorektalen Krebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Lungenkrebs. Seine Hauptaufgabe besteht darin, kritische genomische Variationen zu identifizieren, insbesondere solche, die komplex und umfangreich sind. Beispielsweise erkennt das Nanoporen-Amplicon-Sequencing bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie effektiv TP53-Mutationen. Darüber hinaus ermöglichen die Kombination von Cas9-unterstützter Zielanreicherung mit Nanoporen-Sequencing detaillierte Analysen des Brustkrebs-Suszeptibilitätsgens BRCA1 und seiner angrenzenden Regionen, die einen Bereich von 200 kb abdecken, und bieten Einblicke in das vollständige Spektrum genetischer Veränderungen in relevanten Krankheitsgenen. Das Nanoporen-Sequencing identifiziert auch direkt DNA-Modifikationen und erfasst genomische und epigenomische Veränderungen in Gehirntumorproben, wodurch es ein vielseitiges und schnelles molekulardiagnostisches Werkzeug für Krebs bietet. Darüber hinaus ermöglicht das MinION cDNA-Sequencing die gleichzeitige Erkennung von Fusionsgenen in klinischen Proben. Die Effizienz dieser Technologie optimiert den gesamten Prozess, von der Probenentnahme über die bioinformatische Analyse bis hin zu maßgeschneiderten Behandlungsstrategien, die alles an einem einzigen Tag realisierbar sind. Über Krebs hinaus birgt das Nanoporen-Sequencing erhebliches Potenzial bei der Untersuchung von infektiösen und erblichen Krankheiten.

4. Was sind die Vorteile der Nanoporen-Sequenzierung?

Nanoporen-Sequenzierung verfügt über mehrere Vorteile:

• Die Vorbereitung von Sequenzierungsproben ist äußerst einfach.
• Die Leseweite ist außergewöhnlich lang und erreicht mehrere Millionen Basenpaare, was die Sequenzierung der zweiten Generation um das 1.000-fache übersteigt und auch die Sequenzierung der dritten Generation mit Pac Bio (zehntausende Basenpaare) übertrifft.
• Es kann RNA-Moleküle direkt sequenzieren und epigenetische Modifikationen wie DNA-Methylierung nachweisen.
• Die Kosten sind gering, etwa 150 $ pro Experiment (Durchlauf).
• Die Sequenzierungsgeschwindigkeit ist schnell, die Probenvorbereitung dauert etwa 10 Minuten und die Sequenzierung etwa 40 Minuten.

Häufig gestellte Fragen

1. Was ist der Unterschied zwischen Illumina und Nanopore?

Illumina und Nanopore sind zwei weithin anerkannte Sequenzierungsmethoden, die jeweils durch einzigartige Prinzipien und Betriebsansätze gekennzeichnet sind.

Die Illumina-Sequenzierung, die als Sequenzierung der zweiten Generation kategorisiert wird, folgt dem Prinzip der gleichzeitigen Synthese und Sequenzierung. Diese Methode umfasst das Fragmentieren von DNA in kürzere Sequenzen, gefolgt von paralleler Sequenzierung mit hoher Durchsatzrate. Trotz ihrer lobenswerten Genauigkeit und Kosteneffizienz produziert die Illumina-Sequenzierung typischerweise relativ kurze Leselängen, die in der Regel von einigen Hundert bis zu einigen Tausend Basenpaaren reichen.

Im Gegensatz dazu, Nanoporen-Sequenzierung präsentiert einen einzigartigen Ansatz, bei dem DNA- oder RNA-Moleküle direkt durch Nanoporen sequenziert werden, wodurch die Notwendigkeit einer PCR-Amplifikation entfällt. Während der Nanopore-Sequenzierung, wenn DNA durch winzige Nanoporen fließt, werden Veränderungen im elektrischen Strom, die durch Nukleotide verursacht werden, erfasst und verarbeitet, um DNA-Sequenzen zu generieren. Diese Technik bietet den bemerkenswerten Vorteil von ultra-langen Leselängen, die sich auf Millionen von Basenpaaren erstrecken. Darüber hinaus vereinfacht die Nanopore-Sequenzierung den Prozess und ermöglicht eine schnelle Datenanalyse in Echtzeit. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Nanopore-Sequenzierung im Vergleich zur Illumina-Sequenzierung eine leicht reduzierte Genauigkeit aufweisen kann.

2. Was ist Oxford Nanopore-Sequenzierung?

Oxford Nanopore Sequencing (ONS) ist eine hochmoderne DNA- und RNA-Sequenzierungstechnologie, die von ONT entwickelt wurde. Im Mittelpunkt dieser Technik steht die Nutzung eines nanoskaligen Proteinporen, das in eine hochresistente Polymermembran eingebettet ist. Während des Sequenzierungsprozesses wird eine konstante Spannung über die Membran angelegt, wodurch negativ geladene einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle durch die Nanopore gelangen können. Während diese Nukleinsäuremoleküle die Nanopore durchqueren, erzeugen sie Schwankungen im Ionenstrom, die der Nukleotidsequenz entsprechen, die die Nanopore durchläuft und in Echtzeit mithilfe von Computeralgorithmen decodiert werden kann, was eine sofortige DNA- oder RNA-Sequenzierung ermöglicht. Die Nanopore-Sequenzierungstechnologie bietet mehrere bemerkenswerte Merkmale, darunter lange Leselängen, Echtzeit-Sequenzierung, direkte RNA-Sequenzierung und Tragbarkeit. Die Anwendung von ONT erstreckt sich über verschiedene Bereiche, darunter Genomik, Transkriptomik, Epigenetik und Forschung zu Infektionskrankheiten. Da sich die Technologie weiterentwickelt, wird erwartet, dass ihr Umfang und Einfluss weiter zunehmen.

3. Ist die Nanoporen-Sequenzierung die genaueste?

Nanoporen-Sequenzierung Die Technologie stellt einen innovativen Ansatz für die DNA-Sequenzierung dar und bietet distinct Vorteile, die traditionelle Methoden oft nicht bieten. Zu den bemerkenswerten Merkmalen gehören außergewöhnlich lange Leselängen und die Fähigkeit, Echtzeitdatenanalysen durchzuführen, was sie von herkömmlichen Sequenzierungstechniken unterscheidet. Allerdings, während die Nanoporen-Sequenzierung in diesen Bereichen hervorragend abschneidet, kann ihre Präzision nicht immer mit der alternativer Methoden mithalten. In Bezug auf die Genauigkeit weist die Nanoporen-Sequenzierung häufig höhere Fehlerquoten auf im Vergleich zu etablierten Plattformen wie der Illumina-Sequenzierung. Illumina-Plattformen erzeugen typischerweise kurze Lesedaten mit Fehlerquoten von 0,1 % bis 1 %, während die Nanoporen-Sequenzierung Fehlerquoten zwischen 6 % und 15 % aufweisen kann. Folglich könnten Anwendungen, die höchste Präzision erfordern, wie die Erkennung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) oder die Analyse kleiner Varianten, die Nanoporen-Sequenzierung als suboptimal empfinden.

Um Genauigkeitsprobleme zu mildern, setzen Forscher verschiedene Strategien ein, darunter mehrere Sequenzierungsiterationen desselben DNA-Moleküls zur Generierung von Konsenssequenzen, hybride Fehlerkorrekturansätze, die lange und kurze Lesedaten integrieren, sowie die Weiterentwicklung von Basisaufrufalgorithmen. Trotz dieser Bemühungen bleibt die Genauigkeit der Nanoporen-Sequenzierung durch ihre Einzelmolekül-Sequenzierung begrenzt, die durch ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis auf der Ebene einzelner Moleküle gekennzeichnet ist.

Zusammenfassend bietet die Nanoporen-Sequenzierung unvergleichliche Vorteile in bestimmten Anwendungen, insbesondere in solchen, die lange Leseweiten und Echtzeitanalysen erfordern. Dennoch könnte ihre Präzision die bestimmter etablierter Sequenzierungstechnologien nicht übertreffen. Folglich hängt die Wahl der Sequenzierungsmethodik von den genauen Anforderungen und Zielen des Forschungsprojekts ab.

Referenzen:

1. Deamer D, Akeson M, Branton D. Drei Jahrzehnte der Nanoporen-Sequenzierung. Nat Biotechnol. 2016;34(5):518-524. doi:10.1038/nbt.3423
2. Wang Y, Zhao Y, Bollas A, Wang Y, Au KF. Nanopore-Sequenzierungstechnologie, Bioinformatik und Anwendungen. Nat Biotechnol. 2021;39(11):1348-1365. doi:10.1038/s41587-021-01108-x