Nanoporen-Sequenzierung: Prinzipien, Plattformen und Vorteile

Geschichte der DNA-Sequenzierung

In den letzten fünfzig Jahren haben sich zahlreiche Forscher der Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechnologie gewidmet. Dieser Zeitraum hat drastische Veränderungen erlebt, von kurzen Oligonukleotiden zu Millionen von Basen, von der Sequenzierung einzelner Gene zu Whole-Genome-Sequenzierung, von Short-Read-Sequenzierung zu Long-Read-Sequenzierung und von der Sequenzierung der ersten Generation zur Sequenzierung der dritten Generation. Die von Sanger 1977 entwickelte „Kettenabbruch“- oder Dideoxy-Technik ist einer der Durchbrüche, die den Fortschritt der DNA-Sequenzierungstechnologie für immer verändert haben. Während die Sequenzierung der ersten Generation nur Reads von etwas weniger als einem kb Länge erzeugt, entstand die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) wie Roche 454 und Illumina (massiv parallele Sequenzierung), die die Menge an DNA in einem einzigen Sequenzierungslauf erheblich erhöhte. Die Techniken der dritten Generation erschienen, gekennzeichnet durch Einzelmolekül-, Echtzeit- und Long-Read-Sequenzierung. Die wichtigsten darunter sind PacBio SMRT-Sequenzierung und Nanopore-Sequenzierung. Unter diesen Techniken wird die Nanopore-Sequenzierung als die am meisten erwartete angesehen, um die Goldstandards zu erreichen. Für ein umfassendes Verständnis verweisen Sie bitte auf das Kapitel mit dem Titel "Prinzip der Nanopore-Sequenzierung".

Abbildung 1. Die Geschichte der DNA-Sequenzierungstechnologie.

Nanopore-Sequenzierung und Plattformen

Oxford Nanopore Technologies (ONT) ist das erste Unternehmen, das auf Nanopore-Sequenzierung basiert, und hat viel Aufregung über ihre Nanopore-Plattformen wie MinION^TM, GridION^TM und PromethION^TM erzeugt. Während MinION^TM ein kleines und tragbares Gerät ist, das 2014 veröffentlicht wurde, bieten GridION^TM und PromethION^TM jeweils 5 und 300 Mal die Ausbeute von MinION^TM. Flongle^TM ist ein Adapter für die Sequenzierungsgeräte MinION^TM und GridION^TM X5, der bis zu 1,8 Gb Daten mit Spielraum für über 3 Gb erzeugt.

Abbildung 2. Nanopore-Sequenzierungsplattformen bei ONT.

Ein Nanopore ist ein nanoskaliges Loch. Nanopore-Plattformen verwenden porenbildende Proteine, um Poren in Membranen (biologische Nanoporen) zu erzeugen oder verwenden Nanoporen, die aus synthetischen Materialien hergestellt sind (Solid-State-Nanoporen). Die Oxford Nanopore-Plattformen leiten einen ionischen Strom durch Nanoporen und messen die Veränderungen im Strom, wenn biologische Moleküle durch die Nanopore oder in deren Nähe gelangen. Die Veränderungen werden dokumentiert und übersetzt, um dieses Molekül und die Basismodifikation zu identifizieren.

Abbildung 3. Schematische Darstellung eines Nanopore-Sequenzierungsgeräts.

Die Vorteile der Nanopore-Sequenzierung

Die Nanopore-Sequenzierung stellt eine robuste Technologie im Bereich der DNA-Sequenzierung dar, die unglaublich lange Read-Daten viel günstiger und schneller produziert als zuvor möglich.

• Long-Read-Sequenzierung

Ein wesentlicher Vorteil der Nanopore-Sequenzierung ist die Fähigkeit, ultra-lange Reads zu erzeugen, wobei über 2 Mb Read-Längen erreicht wurden. Die ultra-langen Read-Längen sind eher in der Lage, gesamte Bereiche von repetitiven Sequenzen und strukturellen Variationen abzudecken, was eine vollständigere Sicht auf genetische Variationen und die Möglichkeit zur Rekonstruktion komplexer Genome bietet.

• Direkte RNA-Sequenzierung

Traditionelle RNA-Sequenzierungsansätze erfordern die Umwandlung von RNA in cDNA, was Verzerrungen durch die Rücktranskription oder Amplifikation einführen kann. Die Nanopore-Sequenzierung kann RNA-Moleküle direkt sequenzieren und liefert unverzerrte, vollständige und strangspezifische RNA-Sequenzierung. Das längste Transkript, das derzeit durch Nanopore-Sequenzierung sequenziert wurde, hat eine Länge von über 20 kb. Die direkte RNA-Sequenzierung bringt auch den Vorteil einer genauen Messung der Poly-A-Schwanzlänge mit sich.

• Gezielte Sequenzierungsmethoden

Gezielte Sequenzierung mit Fokus auf spezifische Gene/Regionen kann relevante Daten liefern, zusammen mit reduzierten Kosten, einer höheren Abdeckungstiefe und vereinfachter Datenanalyse. Eine Reihe von gezielten Sequenzierungsmethoden, die sowohl PCR- als auch hybridfängergestützte gezielte Anreicherungsstrategien nutzen, sind für die Nanopore-Sequenzierung verfügbar, wie gezielte Panels und gesamte Exom-Anreicherung. Die Nanopore-Sequenzierung ermöglicht es, viel größere Regionen (einschließlich repetitiver Regionen) in einem einzigen Read zu sequenzieren.

• Gleichzeitige Erkennung von Sequenz- und Basismodifikationen

Basismodifikationen wie 5mC und m6A sind sehr wichtig für die Genexpression und -funktion. Epigenomik ist ein Bereich, der sich auf Basismodifikationen konzentriert. NGS-Techniken erfordern zusätzliche Prozesse, wie die Bisulfitbehandlung, zur Analyse von Basismodifikationen. Die Nanopore-Sequenzierung, die keine PCR-Amplifikation oder Strangsynthese erfordert, kann jedoch sowohl die Base als auch ihre Modifikation (einschließlich m6A, Pseudouridin, 5mC und m7G) im selben Sequenzierungslauf gleichzeitig erkennen.

Referenzen:

1. Heather J M, Chain B. Die Sequenz der Sequenzierer: die Geschichte der Sequenzierung von DNA. Genomics, 2016, 107(1): 1-8.
2. https://nanoporetech.com/