Anwendung der Nanoporen-Sequenzierungstechnologie

Nanoporen-Sequenzierung Die Technologie bietet mehrere herausragende Vorteile, darunter, grob umrissen, lange Leselängen, hohe Ausbeute, Tragbarkeit, Echtzeitbetrieb, Benutzerfreundlichkeit und direkte Lesefähigkeiten. Eine detailliertere Erklärung dieser Vorteile finden Sie im Artikel "Warum Nanopore-Sequenzierung wählen?". Diese Eigenschaften machen diese Technologie in der Genomik äußerst wertvoll. transkriptomische AnalysenDieses Dokument hat zum Ziel, eine Liste typischer Anwendungsfälle bereitzustellen von Nanoporen-Sequenzierung Technologie in aktuellen Anwendungen als Referenzen für die Leser.

Nanoporen-Sequenzierung findet Anwendung in verschiedenen Forschungsbereichen: Genomassemblierung (z. B. Mb-Ebene Langzeit-Sequenzierung), direkte Detektion von Basismodifikationen (z. B. DNA/RNA-Sequenzierung), chromosomale gezielte Sequenzierung und schnelle Echtzeit-Sequenzierung von Metagenomen (Nachweis pathogener Mikroorganismen).

Große Genomassemblierung

Eine der markantesten Eigenschaften der Nanoporen-Sequenzierungstechnologie ist ihre Fähigkeit, Langzeit-Sequenzierung, ein entscheidender Vorteil bei der Assemblierung großer Genome. In der Vergangenheit stellte die Assemblierung von Genomen basierend auf kurzen Fragmenten erhebliche Herausforderungen dar, insbesondere für Organismen mit Eigenschaften wie Polyploidie, umfangreichen Wiederholungen und hoher Heterozygotie. Für bestimmte Pflanzen wie Paris japonica mit einer Genomgröße von 152 Gb und das dekaploide Fragaria turupensis war die Assemblierung mit kurzen Reads unzureichend. Trotz der Einführung von Techniken wie großen Insertbibliotheken, BAC-Bibliotheken, optischem Mapping, Hi-C und Bionano blieben die grundlegenden Herausforderungen der Assemblierung großer Genome bestehen. Das Nanopore-Sequencing erweist sich jedoch als entscheidend, um diese Herausforderungen anzugehen und die Vollständigkeit des Genoms erheblich zu verbessern.

Mikrobielle Schnellidentifikation

Dank der Echtzeit-, schnellen und kompakten Eigenschaften der Nanoporen-Sequenzierungstechnologie ermöglicht sie die direkte Sequenzierung, wodurch die sofortige Erfassung von Sequenzinformationen zur Artenklassifizierung und -identifizierung erleichtert wird, was eine schnelle mikrobielle Erkennung ermöglicht. Mit der Steigerung des Sequenzdurchsatzes wird die Echtzeitüberwachung zunehmend auf Krankheitserreger mit größeren Genomen angewendet, von Viren mit nur wenigen Kilobasen (Kb) über Bakterien mit wenigen Megabasen (Mb) bis hin zu menschlichen Pilzpathogenen mit Genomen von mehr als 10 Mb, die alle vor Ort und in Echtzeit überwacht werden können.

Der Prozess und die schematische Darstellung der 16S rDNA Nanoporen-Sequenzierung. Die Durchlaufzeit betrug etwa 6 bis 8 Stunden von der Probenentnahme bis zu den Ergebnissen. (Yinghu Chen et al., 2023)

Erkennung von antimikrobieller Resistenz in pathogenen Mikroorganismen

Das Auftreten von Antibiotikaresistenzen durch genetische Mutationen in Krankheitserregern stellt eine erhebliche Herausforderung für die klinische Behandlung dar. Derzeit ist der Antimikrobielle Empfindlichkeitstest (AST) die primäre Methode zur Diagnose der mikrobiellen Arzneimittelresistenz. Standard-AST-Methoden haben jedoch ihre Einschränkungen. Nanoporen-Sequenzierung Die Technologie zeichnet sich durch die Erkennung von Mutationen in gezielt medikamentenresistenten Genen aus, bietet Echtzeitunterstützung für die klinische Behandlung und dient als Referenz für die Beurteilung der Patientenprognose. Die Hochdurchsatz-, Hochleistungs- und effiziente Sequenzierungsplattform bietet einen entscheidenden klinischen Wert für die Realzeitüberwachung.

Vollständige Transkriptomanalyse

Historisch gesehen umfasste die Transkriptomanalyse die Sequenzierung von mRNA nach Fragmentierung und reverser Transkription zu cDNA. In diesem Prozess kann PCR einen Amplifikationsbias einführen, was zur Identifizierung von falsch-positiven differentiell exprimierten Genen führt. Trotz der aktuellen Verwendung von Einzelzellmethoden mit molekularen Barcodes zur Reduzierung des PCR-Bias bleibt die Gewinnung und Analyse Vollständige Transkripte bleibt eine Herausforderung. Aufgrund der in Eukaryoten verbreiteten Spleißvariationen hat die Kurzlesesequenzierung weiterhin Schwierigkeiten mit der genauen Identifizierung. Die Nutzung von Nanoporen-Langlesesequenzierung ermöglicht jedoch die präzise Identifizierung mehrerer Isoformen für jedes Gen und bietet einen vereinfachten und genauen Ansatz.

Erfahren Sie mehr: Vollständige Transkript-Sequenzierung: Ein Vergleich zwischen PacBio Iso-Seq und Nanopore Direct RNA-Seq

Direkte RNA-Sequenzierung

Die Nanoporen-Sequenzierungstechnologie zeichnet sich als die einzige Methode aus, die RNA-Ketten direkt sequenzieren kann, ohne dass eine Rücktranskription und Amplifikation erforderlich sind. Dieser Ansatz zeigt keine Sequenzierungspräferenz und erkennt präzise Methylierungsstellen auf RNA-Molekülen, wie m6A- und m5C-Modifikationen. Darüber hinaus bietet die Nanoporen-Sequenzierung eine relativ genaue Schätzung der Poly(A)-Schwanzlängen, was zur Enthüllung authentischer RNA-Eigenschaften beiträgt.

Direkte Detektion von RNA-Modifikationen und -Strukturen mittels Einzelmolekül-Nanoporen-Sequenzierung. (William Stephenson) et al., Zellgenomik 2022)

Große strukturelle Variationen

Genomische Variationen umfassen Einzelne Nukleotidvarianten (SNVs), Insertionen und Deletionen (Indels) sowie strukturelle Varianten (SVs). Whole Exome Sequenzierung (WES)Die auf Kurzlese-Sequenzierung basierende Methode hat Einschränkungen bei der Erkennung struktureller Variationen mit einer Erkennungsrate von unter 50 %. Dies wird auf die Instabilität der Kurzlese-Sequenzierung bei der Identifizierung repetitiver Regionen und die Schwierigkeiten bei der Abdeckung von Bereichen mit hohem GC-Gehalt zurückgeführt. Aktuelle Forschungen bestätigen jedoch die Bedeutung der Charakterisierung dieser repetitiven Regionen und strukturellen Variationen im Zusammenhang mit menschlicher Gesundheit und Krankheitszuständen wie Alterung, Trinukleotid-Wiederholungsstörungen, Autismus, Epilepsie und Krebs. Daher ist die routinemäßige Identifizierung und Charakterisierung dieser Variationen von größter Bedeutung. Die Nanopore-Sequenzierungstechnologie, mit ihren Vorteilen von ultralangen Reads (derzeit bis zu 2,4 MB), dem Fehlen von GC-Bias und der direkten Erkennung von Methylierung, überwindet die Herausforderungen, denen die Kurzlese-Sequenzierung bei der Identifizierung genetischer SVs gegenübersteht, indem sie sich über repetitive Sequenzen erstreckt.

Mutationshaplotypanalyse

Haplotyp-Analyse, auch bekannt als Phasierung, befasst sich grundlegend mit Allelinformationen in diploiden oder polyploiden Genomen und unterscheidet deren elterliche Ursprünge. Dies stellt sicher, dass Informationen vom gleichen Elternteil geordnet auf den jeweiligen Chromosomen angeordnet sind. Offensichtlich hat die Erhöhung der Sequenzlänge positive Auswirkungen auf die Haplotyp-Analyse (insbesondere beim Umgang mit vollständigen Chromosomen, was eine direkte Ausrichtung ermöglicht). Laut Literatur verdoppelt die Anwendung von ultra-langen Reads nicht nur die Kontinuität der Assemblierungen (NG50 ~ 6,4 MB), sondern verbessert auch erheblich die Phasierungseffektivität von allelischen Genen. Beispielsweise wird das Erreichen von Haplotypisierung innerhalb eines einzelnen 16 MB Contigs, insbesondere für den 4 MB Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC), zu einer machbaren Aussicht.

Bakterielle Genomassemblierung

Angesichts der relativ kompakten Größe bakterieller Genome, die typischerweise 10 Mb nicht überschreiten, und ihrer überwiegend einchromosomalen Struktur mit minimalen repetitiven Sequenzen ermöglicht die Long-Read-Fähigkeit der Nanopore-Technologie die Ein-Schritt-Zusammenstellung ganzer Genome innerhalb weniger Minuten (abhängig von der spezifischen Probe und den Hardwarekonfigurationen).

Nanopore-Sequenzierungsläsungen verbessern die Assemblierung und Genannotation von der Parochlus steinenii Genom (Shin, S.C. et al., 2019)

Fazit

Während Plattformen für Langzeit-Sequenzierung, dargestellt durch Nanoporen-Sequenzierung Technologie kann eine geringere Genauigkeit im Vergleich zu Plattformen der zweiten Generation aufweisen. Ihr Auftreten als neuartige Technologie, die vielfältige Auswahl an Reagenzien und das Fehlen standardisierter Analysemethoden tragen dazu bei. Dennoch zeigen diese Plattformen eine lobenswerte Leistung bei der mikrobiellen Identifizierung, der Pathogenerkennung, der onkologischen Forschung und der Erkennung genetischer Erkrankungen. Trotz ihrer aktuellen Einschränkungen besteht ein erhebliches Potenzial für Fortschritte, das neue Perspektiven und Techniken für relevante wissenschaftliche Disziplinen bietet. Nanoporen-Sequenzierung steht kurz davor, einen größeren Forschungswert in verschiedenen Bereichen zu entfalten.

Referenzen:

1. Shin, S.C., Kim, H., Lee, J. u. a.Nanopore-Sequenzierungslässe verbessern die Assemblierung und Genannotation des Parochlus steinenii Genom. Wissenschaftliche Berichte 9, 5095 (2019).
2. Yinghu Chen et al., Verbesserte Zielgerichtetheit der 16S rDNA Nanopore-Sequenzierungsmethode ermöglicht eine schnelle Pathogenidentifizierung bei bakterieller Pneumonie bei Kindern. Front. Cell. Infect. Mikrobiol.., 09. Januar 2023
3. William Stephenson. u. a.Direkte Detektion von RNA-Modifikationen und -Strukturen mittels Einzelmolekül-Nanoporen-Sequenzierung. Zellgenomik 2022