Prinzip der Nanoporen-Sequenzierung

Einführung in die Nanoporen-Sequenzierung

Die Essenz von DNA-Sequenzierung liegt in der Identifizierung der vier Nukleotide: Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G). Der Erkennungsprozess ist jedoch aus zwei Hauptgründen herausfordernd. Erstens sind diese Basen unglaublich klein und existieren im Nanometermaßstab. Zweitens sind die chemischen Strukturen von Purin-Basenpaaren und Pyrimidin-Basenpaaren bemerkenswert ähnlich, was ihre Unterscheidung erschwert. Seit der Proposition der DNA-Doppelhelixstruktur im Jahr 1953 suchen Biologen unermüdlich nach verschiedenen Methoden zur Identifizierung dieser vier Basen.

Aktuelle vorherrschende Sequenzierungsmethoden umfassen die Umwandlung der Anwesenheit der vier Basen in Signale wie Licht, Änderungen des pH-Werts der Lösung oder elektrische Signale. Unterscheidbare Basen werden basierend auf den Unterschieden in ihren amplifizierten Signalen erkannt. Diese Strategien bilden das Rückgrat der aktuellen gängigen Sequenzierungsausrüstung. Bemerkenswerterweise haben Plattformen wie Sanger, Illumina, BGIseq und Pacbio sich für Lichtsignale entschieden. Im Gegensatz dazu nutzt Ion Torrent Variationen im pH-Wert der Lösung, während Nanopore elektrische Signale bevorzugt. Der Sequenzierungsprozess beruht nicht nur auf modernster Technologie, sondern hebt auch den Innovationsaspekt hervor, der einer Kunstform ähnelt.

Das Paradigma von Nanoporen-Sequenzierung Die Technologie hat ihre Anfänge in den 1990er Jahren, und ihre Entwicklung beruht auf drei entscheidenden technologischen Sprüngen. Zunächst wurde die Übertragung einzelner DNA-Moleküle durch ein Nanopore erreicht; ein Erfolg, gefolgt von der Einführung eines enzymatischen Verfahrens am Nanopore zur Überwachung der Sequenzierung mit einer Auflösung auf einzelner Nukleotid-Ebene. Letztendlich wurde die Präzision der Sequenzierung einzelner Nukleotide zur Realität. Diese innovativen Fortschritte haben gemeinsam den Fortschritt von Nanoporen-Sequenzierung Technologie.

Nanoporen-Sequenzierung Prinzip

Nanoporen-Sequenzierung arbeitet nach dem Prinzip, eine künstlich synthetisierte Polymermembran in einer ionischen Lösung zu tauchen. Diese Polymermembran ist mit modifizierten transmembranären Kanalproteinstrukturen durchsetzt, die auch als Nanoporenproteine oder "Reader"-Proteine bekannt sind. Diese Proteine sind für den Betrieb der Nanoporen-Sequenzierung von wesentlicher Bedeutung. Angesichts der biologischen Aktivität des Reader-Proteins sollte der Chip im Kühlschrank bei einer Temperatur von 4-8 °C gelagert und von den Kühlschrankwänden entfernt positioniert werden, um ein Einfrieren aufgrund niedrigerer lokaler Temperaturen zu verhindern.

ONT direkte DNA-Sequenzierung Shangqian (Xie et al., 2021)

Die protein-embedded künstliche Membranstruktur weist unlösliche Eigenschaften auf. Wenn ein externes elektrisches Feld angelegt wird, wird der elektrische Strom ausschließlich durch die Nanoporen geleitet. Unterschiedliche Spannungen, die auf beiden Seiten der Membran angelegt werden, erzeugen einen Spannungsunterschied, der zur Entwindung und Translokation von DNA unter dem Einfluss des Motorproteins durch die Nanopore führt. An diesem Punkt werden einzelne Nukleotide spezifische Änderungen des ionischen Stroms hervorrufen. Diese Membran zeigt hohe elektrische Widerstandseigenschaften. Durch Anlegen eines Potentials an die in einer elektrochemischen Lösung eingetauchte Membran kann an der Nanoporenstelle ein ionischer Strom erzeugt werden.

Elektrischer Strom fließt durch Nanoporen. (Bildnachweis: Oxford Nanopore Technologies)

ONT direkte DNA-Sequenzierung (Shangqian Xie et al., 2021)

Da Nukleinsäuremoleküle in ihrem unbehandelten Zustand einen hohen Grad an Zufälligkeit aufweisen, während sie einer gerichteten Stromfluss unterliegen, ist dies nicht förderlich für die Sequenzierung. Daher erfordert das Nanopore-Sequenzieren, wie andere Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden, ebenfalls den Aufbau einer Bibliothek.

Zwei Stränge des Bibliotheksadapters sind separat mit dem Motorprotein und einem Y-Adapter verbunden. Der Y-Adapter interagiert mit dem Verbindungsarm auf der Membran und unterstützt die Positionierung der Bibliothek am Nanopore. Das Motorprotein am Adapter, das direkt mit dem Nanopore-Protein interagiert, hilft bei der Positionierung der Bibliothek während der Sequenzierung. Es erleichtert das Entwinden der Nukleinsäure und reguliert die Geschwindigkeit der Translokation durch das Pore.

Zusammenfassung

Offensichtlich ist das anfängliche Signal, das von Nanoporen erfasst wird, ein elektrisches. Da das Signal mit der molekularen Größe im Kanalporen zusammenhängt, bleiben verschiedene Modifikationsinformationen über Nukleinsäuren im elektrischen Signal erhalten. Letztendlich speichert der Sequencer das elektrische Signal in Form von 'fast5'-Dateien. Nach dem Prozess der Basenidentifikation werden 'fast5'-Dateien in 'fastq'-Dateien umgewandelt, die die ATCG-Basenfolge enthalten.

Nanopore-Basen werden in Einheiten von fünf Basen pro elektrischer Signal gelesen, was sich von Synthese- während der Sequenzierungsmethoden unterscheidet. Daher sind Q-Werte, die zur Qualitätsbewertung der Sequenzierung der zweiten Generation verwendet werden, streng genommen für die Nanopore-Sequenzierung nicht anwendbar. Die Definition des Q-Wertes ist die Wahrscheinlichkeit eines Fehlers, der für jede gemessene Base auftritt. Daher ist es unangemessen, die Nanopore-Sequenzierung mit einem einzelnen Basisqualitätswert zu bewerten. Die Nanopore-Sequenzierung verwendet ihre eigenen einzigartigen Qualitätskontrollstandards, die als Konsensgenauigkeit bezeichnet werden.

Es ist erwähnenswert, dass die Genauigkeit von Nanoporen kontinuierlich verbessert wird. Im Jahr 2023 sorgt das neu entwickelte Q20-Reagenz dafür, dass die mediane Sequierungsgenauigkeit 99 % übersteigt. Ebenso ist das Hochdurchsatz-Sequencing kein absoluter Standard. Letztendlich bestimmt es die Base an einem bestimmten Locus, indem es die Sequierungstiefe an diesem Locus bewertet.

Für ein tieferes Verständnis von Nanoporen-Sequenzierung, ziehen Sie in Betracht, sich auf die folgenden Artikel zu beziehen: "Warum Nanopore-Sequenzierung wählen?", "Nanoporen-Sequenzierung zur Erkennung struktureller Variationen, HLA-Typisierung und STR-Analyse", "Anwendung der Nanoporen-Sequenzierungstechnologie", "Nanoporen-Sequenzierung: Prinzipien, Plattformen und Vorteile", und "Vollständige Transkript-Sequenzierung: Ein Vergleich zwischen PacBio Iso-Seq und Nanopore Direct RNA-Seq".