Vollständige Transkript-Sequenzierung: Ein Vergleich zwischen PacBio Iso-Seq und Nanopore Direct RNA-Seq

Übersicht

Um die zugrunde liegenden Genomassemblierungen richtig zu nutzen, sind vollständige und präzise Genannotationen wichtig. Die Produktion von hocheffizienten RNA-Sequenzierungstechnologien mit kurzen Reads (oder RNA-seq) hat die Genomforschung erheblich vorangetrieben, indem sie sowohl die Verbesserung der Genomannotationen als auch die Untersuchung von Organismen erleichtert hat, für die noch keine Referenzgenome verfügbar sind. Referenzfreie sowie referenzbasierte Transkripte von kurzen Reads sind jedoch schwierig und stimmen oft nicht mit experimentell verifizierten Genmodellen überein. Tatsächlich liefert die Annotation komplexer Genome, wie die von landwirtschaftlich relevanten Pflanzenarten, noch nicht optimale Ergebnisse. Die Inkonsistenz der zugrunde liegenden Genomassemblierung in Bezug auf unvollständige Rekonstruktionen von Genmodellen erschwert die Genannotationen.

Alle Gene, die in der Zelle oder im Gewebe exprimiert werden, werden durch das Transkriptom dargestellt. Die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ermöglicht die Identifizierung dieser Gene. Für das Experiment zur Differenz in der Genexpression und den Einfluss von Genotyp oder Umwelt auf deren Expression ist die Erstellung eines Referenztranskriptoms entscheidend. Durch die Kurzlesesequenzierung erzeugen die meisten Forschungen ein Referenztranskriptom und rekonstruieren das Transkriptom durch die Assemblierung und/oder das Mapping von Reads auf andere zugängliche Referenzgenome. Für lange Transkripte, repetitive Sequenzen und transponierbare Elemente ist dies jedoch kompliziert.

Für komplexe polyploide Genome ist es besonders herausfordernd. In letzter Zeit hat sich die Langzeit-Sequenzierungstechnologie (LRS), repräsentiert durch PacBio Sequenzierung und Nanoporen-Sequenzierung, ist verfügbar geworden, und diese Technologie überwindet diese Herausforderungen, indem sie vollständige Sequenzdaten als eine einzige Lese-Sequenz erstellt, einschließlich langer Transkripte (z. B. solche, die länger als 10 kb sind), ohne dass eine weitere Zusammenstellung erforderlich ist. In einigen Fällen der Pflanzenforschung wurde diese Methode verwendet und bietet zusätzliche Daten zu Transkriptunterschieden, wie alternative Spleißung und alternative Polyadenylierung.

Vergleich zwischen PacBio Iso-Seq und Nanopore Direct RNA-Seq

Das größte Sequenzierungspotenzial bietet die Technologie von Pacific Biosciences (PacBio) (Isoform-Sequenzierung). Sie kann auch umfassende Datenanalysen bereitstellen. Die Nanoporen-Direkt-RNA-Sequenzierung hingegen hat folgende Vorteile: (1) In Kombination mit schnellen, optimierten Arbeitsabläufen ermöglichen minimale Energieverbrauchsmengen eine äußerst präzise Analyse der Genexpression, (2) Transkripte in voller Länge (die hohe Ausbeute an langen, vollständigen Reads, die durch die Nanoporen-Sequenzierung bereitgestellt werden, ermöglicht eine eindeutige Beschreibung von Spleißvariationen und Genfusionen), (3) Eine präzise Kategorisierung des Transkripts und der Isoform, (4) Verwendung der direkten RNA-Sequenzierung zur Beseitigung von PCR-Bias, (5) Unterscheidung von Basenveränderungen zusammen mit der Nukleotidsequenz mittels direkter RNA, (6) Einfache Erkennung von Antisense-Transkripten.

Abbildung 1. Ein Arbeitsablauf für 3'end-seq (A) und PacBio Iso-seq (B). (Yeh, 2017)

In Bezug auf die Funktion kann PacBio Iso-Seq im Bereich der medizinischen Studien und landwirtschaftlichen Analysen eingesetzt werden. Es kann im medizinischen Bereich für die Transkriptannotierung, die Erforschung von Fusionsgenen und die Bewertung von Krankheitsmechanismen verwendet werden. Es kann für funktionale Forschung, die Erforschung von Fusionsgenen, Fortschritte und Stresstests sowie die Koordination von Genvorhersagen und Genomannotierungen im landwirtschaftlichen Bereich genutzt werden. Nanopore Direct RNA-Seq hingegen kann verwendet werden, um die Genfunktion zu bewerten, indem man sich auf ein Probenmaterial mit bestimmten Funktionen konzentriert, um die Hauptursache für unterschiedliche Funktionen aufzudecken, die Genstruktur wie alternatives Spleißen, APA, Fusionsgene, SSR, CDS-Vorhersage, TSS/TES-Identifikation, die Quantifizierung von vollständigen Transkripten wie das Auffinden breiter und effizienter differentieller Transkripte und die Identifizierung funktioneller Gene sowie RNA-Methylierung wie die direkte Sequenzierung des vollständigen Transkriptoms, die Basismutationen auf RNA-Ebene identifizieren kann, wie m6A/m5C.

Abbildung 2. Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierung. (Byrne, 2017)

Referenzen:

1. Byrne A, Beaudin AE, Olsen HE, u. a.Nanopore-Langlese-RNA-Sequenzierung zeigt weit verbreitete transkriptionale Variation unter den Oberflächenrezeptoren einzelner B-Zellen. Naturkommunikation2017, 8(1).
2. Yeh HS, Zhang W, Yong J. Analysen der alternativen Polyadenylierung: von der alten Biochemie zu Hochdurchsatztechnologien. BMB-Berichte. 2017, 50(4).