Eine Einführung in die reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung (RRBS)

Was ist DNA-Methylierung?

DNA-Methylierung bezieht sich auf die Hinzufügung einer Methylgruppe (CH3) zu dem DNA-Strang, die von DNA-Methyltransferasen (DNMTs) katalysiert wird. DNA enthält vier Arten von stickstoffhaltigen Basen, nämlich Cytosin, Guanin, Thymin und Adenin (Abbildung 1A). Forscher haben herausgefunden, dass Cytosin und Adenin methyliert werden können. Die Cytosin-Methylierung tritt häufig an der 5-Kohlenstoff-Position von Cytosin auf (5-Methylcytosin oder 5mC), die ausschließlich an symmetrischen CG-Stellen auf der DNA-Doppelhelix im gesamten Genom zu finden ist, nämlich in den CpG-Inseln (Abbildung 2B). Die Cytosin-Methylierung ist sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten weit verbreitet (Cloney, 2016; Cooper, 1983). Die Adenin-Methylierung erfolgt an der 6-Stickstoff-Position von Adenin (N6-Methyladenin oder N6mA). Die Adenin-Methylierung wurde in bakterieller, pflanzlicher und tierischer DNA beobachtet (Ratel). u. a.., 2006; Wu u. a.., 2016), wurde jedoch erheblich weniger beachtet (Abbildung 2B).

Abbildung 1. (A) Stickstoffbasen, die in DNA und RNA vorkommen. (B) Die Methylierung von Cytosin und Adenin.

DNA-Methylierung ist eine der wichtigsten epigenetischen Modifikationen, die mit der Genrepression korreliert (Abbildung 2) und eine wesentliche Rolle in der embryonalen Entwicklung, der Aufrechterhaltung der Pluripotenz, der genomischen Prägung und der Inaktivierung des X-Chromosoms spielt, indem sie die Transkription, die Chromatinstruktur und die Chromosomenstabilität reguliert (Robertson, 2005). DNA-Methylierung kann auch die Gesundheit beeinträchtigen und zu Krebs, Autoimmunerkrankungen, neurologischen Störungen oder anderen Krankheiten führen. In vielen Krankheitsprozessen erwerben die CpG-Inseln der Genpromotoren abnormale Hypermethylierung, was zu einer transkriptionalen Stille führt, die von Tochterzellen nach der Zellteilung vererbt werden kann (Wang und Lei, 2018). Veränderungen der DNA-Methylierungsmuster wurden als ein wichtiger Bestandteil der Krebsentwicklung erkannt (Abbildung 3).

Abbildung 2. Die Genexpression kann vor dem Beginn der Transkription durch die chemische Modifikation von DNA oder assoziierten Histonproteinen (DNA-Methylierung und Histon-Acetylierung) reguliert werden (Mukherjee). u. a.., 2015).

Abbildung 3. DNA-Methylierung und Krebs. TSG: Tumorsuppressor-Gen. (Robertson, 2005)

DNA-Methylierungsnachweis und RRBS

Das Verständnis der Rolle der DNA-Methylierung in der Entwicklung und Krankheit erfordert Kenntnisse über die Verteilung dieser Modifikationen im Genom (Harris u. a.., 2010). Die Messung der Gesamtmenge von 5mC oder 5hmC (5-Hydroxymethylcytosin) ermöglicht es Forschern, tiefgreifende biologische Prozesse zu verstehen und Biomarker für Krankheiten zu identifizieren. Die Erkennung von DNA-Methylierungsmustern ist ein schnell fortschreitendes Forschungsgebiet, und es stehen mehrere Methoden zur Bewertung der DNA-Methylierung zur Verfügung, wobei die Bisulfitbehandlung ein zentrales Verfahren für die Mehrheit darstellt. Ein einfacher Algorithmus zur Auswahl einer geeigneten Methode für die DNA-Methylierungsanalyse wird in Abbildung 4 dargestellt (Kurdyukov und Bullock, 2016).

Abbildung 4. Algorithmus zur Auswahl einer geeigneten Methode für die DNA-Methylierungsanalyse. Adaptiert von (Kurdyukov und Bullock, 2016)

Bisulfid-Sequenzierung ist die Anwendung der Bisulfidbehandlung von DNA, um ihr Methylierungsmuster zu bestimmen. u. a.Die Bisulfidbehandlung von DNA vermittelt die Deaminierung von Cytosin zu Uracil, und diese umgewandelten Reste werden als Thymin gelesen, wie durch PCR-Amplifikation und anschließende Sequenzanalyse bestimmt (Abbildung 5).

Abbildung 5. Messung der DNA-Methylierung durch Bisulfit-Sequenzierung (Bild von Illumina).

Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS) ist die umfassendste Methode zur Analyse der DNA-Methylierung und wird mittlerweile als die „Goldstandard“-Methode in Studien zur DNA-Methylierung angesehen. Die einzigen Einschränkungen sind die Kosten und die Schwierigkeiten bei der Analyse von NGS-Daten. Reduzierte Repräsentation Bisulfite-Sequenzierung (RRBS), das Restriktionsenzyme und Bisulfit-Sequenzierung kombiniert, um Bereiche des Genoms mit hohem CpG-Gehalt anzureichern, ist eine effiziente und hochdurchsatzfähige Technik zur Analyse der genomweiten Methylierungsprofile auf Einzel-Nukleotid-Ebene. Die Methode kann die Anzahl der benötigten Nukleotide für die Sequenzierung auf 1 % des Genoms reduzieren (Meissner u. a.., 2005). Aufgrund seiner wirtschaftlichen und produktiven Art, RRBS wurde verwendet, um abweichende Methylierung bei Krebs schnell zu profilieren (Smith u. a.., 2009) und Methylierungszustände in der Entwicklung.

Workflow von RRBS

Das Protokoll von RRBS ist in Abbildung 6 dargestellt. Der Prozess besteht aus mehreren Schritten:

• Enzymatische Verdauung Genomisches DNA wird mit einem methylierungsunempfindlichen Restriktionsenzym in DNA-Fragmente verschiedener Größen zerlegt. MspI wird häufig verwendet.
• Bibliotheksvorbereitung Nach der Enzymverdauung erfolgt die Bibliotheksvorbereitung, ein Prozess, der aus der Endreparatur, A-Tailing und der Ligierung von Sequenzadaptern besteht. Die Reaktion des MspI-Verdaues führt zu Strängen mit überstehenden Enden. Die Endreparatur ist notwendig, um die 3'-Enden der Stränge zu vervollständigen. A-Tailing, bei dem ein zusätzliches Adenosin zu sowohl dem Plus- als auch dem Minusstrang hinzugefügt wird, ist notwendig für die Ligierung des methylierten Sequenzadapters im folgenden Schritt.
• Größenauswahl Anschließend erfolgt eine Größenselektion der resultierenden Fragmente. Verschiedene Größen der Fragmente werden durch Gelelektrophorese getrennt und mittels Gel-Ausschneidung gereinigt.
• Bisulfit-Konversion Nach der Größenauswahl wird die Bisulfit-Konversion durchgeführt, bei der unmethyliertes Cytosin zu Uracil deaminiert wird.
• PCR-Amplifikation und -Reinigung Die bisulfite-konvertierte DNA wird dann mit PCR amplifiziert, wobei Primer verwendet werden, die komplementär zu den Sequenzadaptern sind. Ein Schritt zur PCR-Reinigung ist vor der Sequenzierung erforderlich.
• Sequenzierung Die Sequenzierung wird dann unter Verwendung von Next-Generation-Sequencing-Technologie durchgeführt. Die Illumina-Plattformen werden am häufigsten verwendet.

Abbildung 6. Protokoll zur reduzierten Repräsentation von Bisulfit-Sequenzierung.

Vorteile und Einschränkungen von RRBS

RRBS hat einige technische Vorteile gegenüber WGBS und anderen Methoden zur Erkennung von DNA-Methylierung. Es gibt jedoch auch einige Einschränkungen in den spezifischen Protokollschritten.

• Vorteile:
• Durch die Nutzung spezifischer Restriktionsenzyme kann RRBS CpG-Regionen des Genoms anreichern und die benötigte Sequenziermenge sowie die Kosten senken.
• Es ist nur eine niedrige Probenkonzentration erforderlich, um eine genaue Datenanalyse durchzuführen.
• Einschränkungen
• Die Restriktionsenzymverdauung konnte nicht alle CG-Bereiche im Genom abdecken. Einige CpGs wurden übersehen und einige Regionen haben daher eine geringere Abdeckung.
• PCR-Amplifikationsfehler könnten auftreten.
• Die vollständige Bisulfit-Konversion von doppelsträngigem DNA (dsDNA) erfordert einen Denaturierungsschritt, da die Bisulfit-Sequenzierung nur einfachsträngige DNA (ssDNA) konvertiert.

Bei CD Genomics sind wir bestrebt, zuverlässige Epigenomik-Sequenzierung Dienstleistungen, einschließlich gezielte Bisulfid-Sequenzierung, reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung (RRBS), Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung, MeDIP-Sequenzierung, und ChIP-seq.

Referenzen:

1. Cloney, R. (2016). DNA-Methylierung: Eine SMRT-Analyse prokaryotischer Epigenome. Naturwissenschaftliche Rezensionen Genetik 17, 195.
2. Cooper, D.N. (1983). Eukaryotische DNA-Methylierung. Humangenetik 64, 315-333.
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4. Harris, R.A., Wang, T., Coarfa, C., Nagarajan, R.P., Hong, C., Downey, S.L., Johnson, B.E., Fouse, S.D., Delaney, A., Zhao, Y.u. a. (2010). Vergleich von sequenzierungsbasierten Methoden zur Profilierung der DNA-Methylierung und Identifizierung monoallelic epigenetischer Modifikationen. Naturbiotechnologie 28, 1097-1105.
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