Eine Einführung in die reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung (RRBS)

Was ist DNA-Methylierung?

DNA-Methylierung bezieht sich auf die Addition einer Methylgruppe (CH3) an den DNA-Strang, die von DNA-Methyltransferasen (DNMTs) katalysiert wird. DNA enthält vier Arten von stickstoffhaltigen Basen, nämlich Cytosin, Guanin, Thymin und Adenin (Abbildung 1A). Forscher haben herausgefunden, dass Cytosin und Adenin methyliert werden können. Die Cytosin-Methylierung erfolgt häufig an der 5-Kohlenstoff-Position von Cytosin (5-Methylcytosin oder 5mC), die ausschließlich an symmetrischen CG-Stellen auf der DNA-Doppelhelix im gesamten Genom zu finden ist, nämlich der CpG-Insel (Abbildung 2B). Die Cytosin-Methylierung ist sowohl bei Eukaryoten als auch bei Prokaryoten weit verbreitet (Cloney, 2016; Cooper, 1983). Die Adenin-Methylierung erfolgt an der 6-Stickstoff-Position von Adenin (N6-Methyladenin oder N6mA). Die Adenin-Methylierung wurde in bakterieller, pflanzlicher und tierischer DNA beobachtet (Ratel). u. a.., 2006; Wu u. a.., 2016), erhielt jedoch deutlich weniger Aufmerksamkeit (Abbildung 2B).

Abbildung 1. (A) Stickstoffbasen, die in DNA und RNA vorkommen. (B) Die Methylierung von Cytosin und Adenin.

DNA-Methylierung ist eine der wichtigsten epigenetischen Modifikationen, die mit der Genrepression korreliert ist (Abbildung 2) und eine wesentliche Rolle in der embryonalen Entwicklung, der Aufrechterhaltung der Pluripotenz, der genomischen Prägung und der Inaktivierung des X-Chromosoms durch Regulierung der Transkription, der Chromatinstruktur und der Chromosomenstabilität spielt (Robertson, 2005). DNA-Methylierung kann auch die Gesundheit beeinflussen und zu Krebs, Autoimmunerkrankungen, neurologischen Störungen oder anderen Krankheiten führen. In vielen Krankheitsprozessen erwerben die CpG-Inseln der Genpromotoren eine abnormale Hypermethylierung, die zu einer transkriptionalen Stille führt, die von Tochterzellen nach der Zellteilung vererbt werden kann (Wang und Lei, 2018). Veränderungen der DNA-Methylierungsmuster wurden als ein wichtiger Bestandteil der Krebsentwicklung anerkannt (Abbildung 3).

Abbildung 2. Die Genexpression kann vor dem Beginn der Transkription durch die chemische Modifikation von DNA oder assoziierten Histonproteinen (DNA-Methylierung und Histon-Acetylierung) reguliert werden (Mukherjee). u. a.., 2015).

Abbildung 3. DNA-Methylierung und Krebs. TSG: Tumorsuppressor-Gen. (Robertson, 2005)

DNA-Methylierungsnachweis und RRBS

Das Verständnis der Rolle der DNA-Methylierung in der Entwicklung und Krankheit erfordert Kenntnisse über die Verteilung dieser Modifikationen im Genom (Harris u. a.., 2010). Die Messung der Gesamtmenge an 5mC oder 5hmC (5-Hydroxymethylcytosin) ermöglicht es Forschern, Einblicke in tiefgreifende biologische Prozesse zu gewinnen und Biomarker für Krankheiten zu identifizieren. Die Erkennung von DNA-Methylierungsmustern ist ein schnell fortschreitendes Forschungsgebiet, und mehrere Methoden zur Bewertung der DNA-Methylierung stehen zur Verfügung, wobei die Bisulfitbehandlung ein zentrales Verfahren für die Mehrheit darstellt. Ein einfacher Algorithmus zur Auswahl einer geeigneten Methode für die DNA-Methylierungsanalyse ist in Abbildung 4 dargestellt (Kurdyukov und Bullock, 2016).

Abbildung 4. Algorithmus zur Auswahl einer geeigneten Methode für die DNA-Methylierungsanalyse. Adaptierte von (Kurdyukov und Bullock, 2016)

Bisulfid-Sequenzierung ist die Anwendung von Bisulfidbehandlung von DNA, um ihr Methylierungsmuster zu bestimmen. u. a.., 1992). Die Bisulfitbehandlung von DNA vermittelt die Deaminierung von Cytosin zu Uracil, und diese umgewandelten Reste werden als Thymin gelesen, wie durch PCR-Amplifikation und anschließende Sequenzanalyse bestimmt (Abbildung 5).

Abbildung 5. Messung der DNA-Methylierung durch Bisulfit-Sequenzierung (Bild aufgenommen von Illumina).

Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS) ist die umfassendste Methode zur Analyse der DNA-Methylierung und wird mittlerweile als die „Goldstandard“-Methode in Studien zur DNA-Methylierung angesehen. Die einzigen Einschränkungen sind die Kosten und die Schwierigkeiten bei der Analyse von NGS-Daten. Reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung (RRBS), das Restriktionsenzyme und Bisulfit-Sequenzierung kombiniert, um Bereiche des Genoms mit hohem CpG-Gehalt anzureichern, ist eine effiziente und hochdurchsatzfähige Technik zur Analyse der genomweiten Methylierungsprofile auf Einzel-Nukleotid-Ebene. Die Methode kann die Anzahl der benötigten Nukleotide zur Sequenzierung auf 1 % des Genoms reduzieren (Meissner). u. a.., 2005). Aufgrund seiner wirtschaftlichen und produktiven Art, RRBS wurde verwendet, um abnormale Methylierung bei Krebs schnell zu profilieren (Smith u. a.., 2009) und Methylierungszustände in der Entwicklung.

Workflow von RRBS

Das Protokoll von RRBS ist in Abbildung 6 dargestellt. Der Prozess besteht aus mehreren Schritten:

• Enzymatische Verdauung Genomisches DNA wird mit einem methylierungsunempfindlichen Restriktionsenzym in DNA-Fragmente verschiedener Größen zerschnitten. MspI wird häufig verwendet.
• Bibliotheksvorbereitung Nach der Enzymverdauung erfolgt die Bibliotheksvorbereitung, ein Prozess, der aus der Endreparatur, A-Tailing und der Ligation von Sequenzadaptern besteht. Die Reaktion des MspI-Verdauens führt zu Strängen mit klebrigen Enden. Die Endreparatur ist notwendig, um die 3'-Enden der Stränge zu vervollständigen. A-Tailing, bei dem ein zusätzliches Adenosin zu sowohl den Plus- als auch den Minussträngen hinzugefügt wird, ist für die Ligation von methylierter Sequenzadapter im nächsten Schritt erforderlich.
• Größenauswahl Anschließend wird eine Größenwahl der resultierenden Fragmente durchgeführt. Verschiedene Größen der Fragmente werden durch Gel-Elektrophorese getrennt und mittels Gel-Ausschneidung gereinigt.
• Bisulfit-Konversion Nach der Größenwahl wird die Bisulfit-Konversion durchgeführt, bei der unmethylierte Cytosine zu Uracil deaminiert werden.
• PCR-Amplifikation und -Reinigung Die bisulfite-konvertierte DNA wird dann mit PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die komplementär zu den Sequenzadaptern sind. Ein Schritt zur PCR-Reinigung ist vor der Sequenzierung erforderlich.
• Sequenzierung Die Sequenzierung wird dann mit Hilfe von Next-Generation-Sequencing-Technologie durchgeführt. Die Illumina-Plattformen werden am häufigsten verwendet.

Abbildung 6. Protokoll für reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung.

Vorteile und Einschränkungen von RRBS

RRBS hat einige technische Vorteile gegenüber WGBS und anderen Methoden zur Erkennung von DNA-Methylierung. Es gibt jedoch auch einige Einschränkungen in den spezifischen Protokollschritten.

• Vorteile:
• Durch die Nutzung spezifischer Restriktionsenzyme kann RRBS CpG-Regionen des Genoms anreichern und die erforderliche Sequenziermenge sowie die Kosten senken.
• Es ist nur eine niedrige Probenkonzentration erforderlich, um eine genaue Datenanalyse durchzuführen.
• Einschränkungen
• Die Restriktionsenzymverdauung konnte nicht alle CG-Bereiche im Genom abdecken. Einige CpGs wurden übersehen und einige Regionen haben daher eine geringere Abdeckung.
• PCR-Amplifikationsfehler könnten auftreten.
• Die vollständige Bisulfitkonversion von doppelsträngiger DNA (dsDNA) erfordert einen Denaturierungsschritt, da die Bisulfit-Sequenzierung nur einfachsträngige DNA (ssDNA) konvertiert.

Bei CD Genomics sind wir bestrebt, zuverlässige Epigenomik-Sequenzierung Dienstleistungen, einschließlich gezielte Bisulfid-Sequenzierung, reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung (RRBS), Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung, MeDIP-Sequenzierungund ChIP-seq.

Referenzen:

1. Cloney, R. (2016). DNA-Methylierung: Eine SMRT-Analyse prokaryotischer Epigenome. Naturwissenschaften Reviews Genetik 17, 195.
2. Cooper, D.N. (1983). Eukaryotische DNA-Methylierung. Humangenetik 64, 315-333.
3. Frommer, M., McDonald, L.E., Millar, D.S., Collis, C.M., Watt, F., Grigg, G.W., Molloy, P.L. und Paul, C.L. (1992). Ein genomisches Sequenzierungsprotokoll, das eine positive Anzeige von 5-Methylcytosin-Resten in einzelnen DNA-Strängen liefert. Sitzungsberichte der Nationalen Akademie der Wissenschaften der Vereinigten Staaten von Amerika 89, 1827-1831.
4. Harris, R.A., Wang, T., Coarfa, C., Nagarajan, R.P., Hong, C., Downey, S.L., Johnson, B.E., Fouse, S.D., Delaney, A., Zhao, Y.u. a. (2010). Vergleich von sequenzbasierten Methoden zur Profilerstellung der DNA-Methylierung und Identifizierung monoalleler epigenetischer Modifikationen. Naturbiotechnologie 28, 1097-1105.
5. Kurdyukov, S., und Bullock, M. (2016). DNA-Methylierungsanalyse: Die richtige Methode wählen. Biologie 5.
6. Meissner, A., Gnirke, A., Bell, G.W., Ramsahoye, B., Lander, E.S., und Jaenisch, R. (2005). Reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung zur vergleichenden Hochauflösungs-DNA-Methylierungsanalyse. Forschung zu Nukleinsäuren 33, 5868-5877.
7. Mukherjee, K., Twyman, R.M. und Vilcinskas, A. (2015). Insekten als Modelle zur Untersuchung der epigenetischen Grundlagen von Krankheiten. Fortschritte in der Biophysik und Molekularbiologie 118, 69-78.
8. Ratel, D., Ravanat, J.L., Berger, F. und Wion, D. (2006). N6-Methyladenin: die andere methyliert Base der DNA. BioEssays: Nachrichten und Rezensionen in molekularer, zellulärer und Entwicklungsbiologie 28, 309-315.
9. Robertson, K.D. (2005). DNA-Methylierung und menschliche Krankheiten. Naturwissenschaftliche Rezensionen Genetik 6, 597-610.
10. Smith, Z.D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A. und Meissner, A. (2009). Hochdurchsatz-Bisulfid-Sequenzierung in Säugetiergenomen. Methoden 48, 226-232.
11. Wang, Y.P., und Lei, Q.Y. (2018). Metabolische Rekodierung der Epigenetik bei Krebs. Krebs-Kommunikation 38, 25.
12. Wu, T.P., Wang, T., Seetin, M.G., Lai, Y., Zhu, S., Lin, K., Liu, Y., Byrum, S.D., Mackintosh, S.G., Zhong, M.u. a. (2016). DNA-Methylierung an N(6)-Adenin in embryonalen Stammzellen von Säugetieren. Natur 532, 329-333.