Sanger-Sequenzierung zur Validierung von Next-Generation-Sequencing

Die molekulare Biologie schreitet ständig voran, und genetische Technologien erfahren kontinuierliche Aktualisierungen und Verbesserungen. 1977 markierte die Erfindung der Dideoxy-Kettenabbruchmethode durch Sanger einen Meilenstein im Bereich der Sequenzierung und läutete eine neue Ära in der Analyse von Nukleinsäuren ein, die das Zeitalter der Automatisierung für die genetische Sequenzierung einleitete. In der Folge traten Technologien der zweiten Generation auf, wie zum Beispiel Next-Generation Sequencing (NGS), die Effizienz und die Fähigkeiten von Sequenzierungstechniken weiter verbessert haben.

Konfrontiert mit riesigen Mengen genetischer Informationen, ähnlich den funkelnden Sternen am Nachthimmel, stellt die Komplexität der genetischen Vererbung erhebliche Herausforderungen dar. Während wir die Möglichkeiten der NGS-Technologie nutzen, ist die Gewährleistung der Qualität der NGS-Sequenzierung zu einem dringenden Thema geworden, das unsere sofortige Aufmerksamkeit erfordert.

In diesem Artikel gehen wir auf die Bedeutung der NGS-Validierung, den Workflow der NGS-Bestätigung und die Gründe ein, warum die Validierung in der genomischen Analyse unerlässlich ist.

Was ist NGS-Validierung?

Die NGS-Validierung ist die systematische Bewertung der Genauigkeit, Präzision und Zuverlässigkeit von NGS-Assays und -Plattformen. Dieser Prozess umfasst umfassende Tests, um die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der von NGS-Technologien erzeugten Ergebnisse zu gewährleisten. Die Validierung umfasst eine Reihe von Parametern, einschließlich analytischer Sensitivität, Spezifität, Präzision und Genauigkeit.

Bewertung der analytischen Sensitivität und Spezifität

Analytische Sensitivität bezeichnet die Fähigkeit eines NGS-Tests, echte positive Varianten zu identifizieren, insbesondere solche, die bei niedrigen allelischen Frequenzen vorkommen. Im Gegensatz dazu bezieht sich die analytische Spezifität auf die Fähigkeit des Tests, echte negative Ergebnisse präzise zu erkennen und gleichzeitig falsch positive Ergebnisse zu minimieren.

Präzision und Genauigkeit

Präzision quantifiziert das Ausmaß der Reproduzierbarkeit oder Wiederholbarkeit von Ergebnissen innerhalb eines einzelnen Tests oder über mehrere Tests hinweg. Im Gegensatz dazu beschreibt Genauigkeit das Maß, in dem die erzeugten NGS-Daten mit der authentischen genomischen Sequenz übereinstimmen.

NGS-Bestätigungs-Workflow

Der Workflow zur Bestätigung in NGS ist entscheidend für die Erhaltung der Zuverlässigkeit und Genauigkeit der genomischen Daten, die von NGS-Plattformen gesammelt wurden. Dieser komplexe Prozess umfasst mehrere Phasen, die darauf abzielen, die erkannten Varianten mithilfe komplementärer Methoden zu verifizieren, wie zum Beispiel Sanger-SequenzierungDer folgende Diskurs untersucht weiter die einzelnen Phasen des NGS-Bestätigungs-Workflows:

Variantenidentifikation durch NGS

Beginnend mit der Identifizierung von Varianten durch NGSDiese Plattformen setzen fortschrittliche Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ein, die große Mengen an Sequenzierungsdaten aus genomischen DNA-Proben liefern. Diese anfängliche Phase im Bestätigungsworkflow umfasst die Identifizierung von Varianten, wobei der Einsatz von bioinformatischen Instrumenten entscheidend ist, um die umfangreichen Rohsequenzierungsdaten zu analysieren und genetische Variationen zu erkennen, einschließlich SNVs, Insertionen, Deletionen und strukturellen Abweichungen.

Dieser Prozess umfasst die Ausrichtung von Sequenzierungsinterpretationen auf ein Referenzgenom, die Unterscheidung von Varianten und die Kommentierung ihrer funktionalen und klinischen Bedeutungen.

Auswahl der Varianten zur Bestätigung

Nicht alle Varianten erkannt durch NGS die Validierung über orthogonale Ansätze. Varianten, die vordefinierte Qualitätsbenchmarks überschreiten, einschließlich Abdeckungstiefe, Variantenallelfrequenz und Präzision der Variantenbestimmung, können als robust angesehen werden und sind von Bestätigungsverfahren ausgenommen. Varianten, die jedoch diese Qualitätsstandards nicht erfüllen oder klinische Relevanz besitzen, können zusätzliche Validierung durch Bestätigungsassays erfordern, wie zum Beispiel Sanger-Sequenzierung.

Sanger-Sequenzierungsbestätigung

Sanger-Sequenzierung, allgemein als Kettenabbruch-Sequenzierung bezeichnet, ist eine klassische DNA-Sequenzierungstechnik, die als Maßstab für die Bestätigung genetischer Varianten angesehen wird, die durch NGSWährend der Validierungsphase werden die gezielten Segmente, die die identifizierten Varianten enthalten, durch PCR mit speziell dafür entwickelten Primern amplifiziert. Anschließend werden die amplifizierten Fragmente einer Sanger-Sequenzierung unterzogen, bei der die Einfügung von kettenabbrechenden Dideoxynukleotiden die Sequenzierung einzelner DNA-Fragmente ermöglicht. Die resultierenden Sequenzierungsdaten werden sorgfältig analysiert, um die Nukleotidsequenz zu entschlüsseln und somit das Vorhandensein der betreffenden Variante zu bestätigen.

Datenanalyse und -interpretation

Nach Abschluss von Sanger-Sequenzierung, die resultierenden Daten werden mit den Originaldaten verglichen. NGS Datensatz zur Bewertung der Übereinstimmung. Alle Inkonsistenzen zwischen diesen Datensätzen werden einer gründlichen Prüfung unterzogen, um die Genauigkeit der NGS-Variantenerkennungen festzustellen. Die Bestätigung der Variante durch Sanger-Sequenzierung erhöht das Vertrauen in die Zuverlässigkeit der NGS-Ergebnisse. Im Gegensatz dazu führen abweichende Befunde zu weiteren Untersuchungen, um potenzielle Faktoren wie Sequenzierungsfehler, Ausrichtungsanomalien oder Probenkontamination zu klären.

Durch die akribische Einhaltung des NGS-Bestätigungsprotokolls wahren Labore die Integrität und Präzision der genomischen Daten, die von NGS-Plattformen stammen. Dieses sorgfältige Validierungsregime spielt eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung klinischer Entscheidungsfindung, der Abgrenzung personalisierter Therapieansätze und der Wahrung der höchsten Standards in der Patientenversorgung.

Warum ist die NGS-Validierung notwendig?

Trotz der weit verbreiteten Einführung und ständigen Verfeinerung von Standardverfahren für NGSDie Leistungsvalidierung bleibt ein unverzichtbarer Schritt. Dies liegt hauptsächlich daran, dass die Leistungsvalidierung die Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Konsistenz von NGS in praktischen Anwendungen gewährleistet und somit die Qualität und Sicherheit klinischer Diagnosen und Behandlungen schützt.

1. Mehrere Faktoren, die die Erkennungsergebnisse beeinflussen

Die Umsetzung von NGS Technologie ist nicht nur durch Faktoren wie die Fachkenntnisse des Personals, Laborbedingungen, die Qualität von Instrumenten und Reagenzien sowie die Standardisierung von Betriebsverfahren eingeschränkt, sondern auch anfällig für die Einführung von Fehlern in jedem Schritt, da sie zahlreiche Phasen umfasst, was die endgültigen Detektionsergebnisse erheblich beeinflussen kann. Insbesondere können potenzielle Probleme Folgendes umfassen:

• Während des Bauprozesses der Bibliothek kann unsachgemäße Handhabung zu einem Versagen der Verbindung von Tags oder Adaptern führen.
• Abweichungen oder Fehler in den Annotationsphasen können zu analytischen Verzerrungen führen.
• Automatisierte Extraktionstechniken können gelegentlich Kreuzkontaminationen zwischen Proben verursachen, was die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigt.
• Ineffiziente Sondenaufnahme kann die effektive Erfassung von Zielsequenzen behindern.
• Identifikationsfehler während des Tagging-Prozesses können zu einer Fehlinterpretation der Daten führen.
• Unangemessene Parameter-Einstellungen oder übermäßige Datenfilterung während der Datenanalyse-Phase können die Zuverlässigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen.
• Fehler im Prozess der Variantenidentifikation können zu Fehlurteilen über die Variantenarten führen.
• Optische Verzerrungen in der Optik des Sequenzierungsgeräts können Probleme mit der Basisqualität der Sequenzierung hervorrufen, was wiederum die Genauigkeit der Sequenzierung beeinflusst.

Angesichts der oben genannten Gründe weisen verschiedene Prozesse und Labore oft bestimmte Unterschiede in der Sequenzierungsqualität und den Ergebnissen der Informationsanalyse bei der Implementierung von NGS-Technologie auf. Daher ist es in praktischen Anwendungen unerlässlich, die operative Qualität in jeder Phase streng zu kontrollieren, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Daten sicherzustellen.

2. Zusätzliche Methoden zur Sicherstellung der NGS-Analyse und klinischen Nützlichkeit

Die Fähigkeit von NGS Die Tests zur Identifizierung von Varianten mit signifikanter klinischer Relevanz sowie solcher, deren klinische Bedeutung unklar bleibt, erfordern erhebliche Variationen in den Anforderungen an die klinische Validierung für jede Variante. Darüber hinaus konzentriert sich der primäre erwartete Nutzen von NGS-Tests auf spezifische Patientenkohorten, Medikamente oder Krankheitsbereiche. Wie die Forschungsergebnisse des Molecular Analysis for Therapy Choice (MATCH)-Programms des National Cancer Institute zeigen, sollte die Auswahl von Therapeutika oder Wirkstoffen für die Behandlung auf spezifischen molekularen Befunden basieren, die durch gezielte NGS-Analysen offenbart werden, anstatt sich ausschließlich auf die Klassifizierung des Krebs Typs zu verlassen.

Der rasche Fortschritt der gezielten Anreicherungstechniken und NGS hat die klinische Diagnosetests grundlegend transformiert. Es ermöglicht die gleichzeitige Analyse aller Gene, die an Krankheitsphänotypen beteiligt sind, zu geringeren Kosten und übertrifft damit die herkömmliche Kapillarelektrophorese-Sequenzierung, wodurch es zur bevorzugten Methode für die meisten Hochdurchsatz-Diagnoselabore geworden ist. Gezielte NGS-Panels sind zur vordersten Methode zur Erkennung verschiedener genetischer Störungen geworden. Mit der weitverbreiteten Einführung von NGS haben zahlreiche Diagnoselabore Panels für Gene, die mit erblichen Krebserkrankungen in Verbindung stehen, eingeführt, die in der Lage sind, verschiedene charakteristische Gene zu erkennen, die mit erblichen Krebsarten assoziiert sind.

Es gibt zahlreiche Panels, die für die Testung bekannter Genmutationen im Zusammenhang mit erblichen Krebserkrankungen zur Verfügung stehen. Die Genauigkeit dieser Tests kann von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden, einschließlich gezielter Anreicherungsplattformen, Sequenzierungstechnologien, verwendeter bioinformatischer Arbeitsabläufe und Fachkenntnissen in der Varianteninterpretation.

3. Die Bedeutung der NGS-Überwachung

Treue zu ihrem Engagement für die Gewährleistung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit von genomischen Daten, die aus NGS Technologien, angesehene Institutionen wie die Centers for Disease Control and Prevention (CDC), das American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) und die American Society for Clinical Pathology (ASCP) haben gemeinsam eine Reihe von sorgfältigen Richtlinien festgelegt. Diese normativen Anweisungen beziehen sich auf die effektive Validierung von NGS-Methoden, die sorgfältige Überwachung analytischer Prozesse sowie die umfassende Berichterstattung über identifizierte Varianten. Im Vergleich zu herkömmlichen molekularen Nachweismethoden weist die klinische Prüfung mittels NGS charakteristisch erheblich komplexe Aspekte auf, was die kritische Notwendigkeit robuster Validierungsprozesse für NGS-abgeleitete Ergebnisse unterstreicht.

4. Herausforderungen bei der Bereitstellung von Leitlinien für die Präzisionsmedizin

In einer Epoche, die zunehmend durch Präzisionsmedizin und personalisierte Therapien geprägt ist, spielt genetisches Testen eine wesentliche Rolle bei der Steuerung nachfolgender therapeutischer Strategien, die auf die Bedürfnisse einzelner Patienten zugeschnitten sind. Die Aktualität und Genauigkeit solcher diagnostischer Befunde bieten Klinikern überzeugende Beweise, um die Auswahl der Patienten zu informieren, die am besten für spezifische Behandlungsstrategien geeignet sind, und erhöhen somit die Behandlungseffizienz. Trotz der erheblichen Vorteile, die NGS bietet - insbesondere die Fähigkeit, eine Vielzahl von Variationen im menschlichen Genom zu identifizieren - bleibt es dennoch unzureichend, um eine individuelle Validierung und Überprüfung jeder postulierten Variation zu erreichen. Angesichts der Heterogenität der Auswahlkriterien über verschiedene pathologische Entitäten hinweg macht dieses Manko... NGS Technologie ist in der Bereitstellung präziser therapeutischer Anleitungen während kritischer und nicht reproduzierbarer klinischer Szenarien, die Dringlichkeit erfordern, etwas unzureichend.

Next-Generation Sequencing

Die Next-Generation-Sequenzierung, auch bekannt als Hochdurchsatzsequenzierung, hat sich aus DNA-Sequenzierungstechnologien entwickelt, die auf PCR und Gen-Chips basieren.

Die Sequenzierung der zweiten Generation führte reversible Terminierung an den Enden ein und ermöglichte damit die Sequenzierung durch Synthese. Bei der Sequenzierung der zweiten Generation wird die DNA-Sequenz bestimmt, indem die speziellen Marker (in der Regel fluoreszierende molekulare Etiketten) erfasst werden, die von den neu hinzugefügten Basen während des DNA-Replikationsprozesses getragen werden. Die bestehenden Technologieplattformen umfassen hauptsächlich Roche's 454 FLX und Illumina's Miseq/Hiseq.

Bei der Sequenzierung der zweiten Generation müssen einzelne DNA-Moleküle in Gencluster aus identischer DNA amplifiziert und dann synchron repliziert werden, um die Fluoreszenzsignalintensität zur Lesung der DNA-Sequenz zu erhöhen. Mit zunehmender Leselänge nimmt die Synergie der Gencluster-Replikation ab, was zu einem Rückgang der Sequenzierungsqualität der Basen führt. Dies begrenzt strikt die Leselänge der Sequenzierung der zweiten Generation (nicht mehr als 500 bp) und verleiht ihr somit die Eigenschaften von hoher Durchsatzrate und kurzer Leselänge.

Sanger-Sequenzierung

Sangers Dideoxy-Kettenabbruch-Sequenzierungsmethode ist der Mainstream der Sequenzierung der ersten Generation, oft als Sanger-SequenzierungIn vier DNA-Synthesereaktionssystemen wird ein bestimmter Anteil an ddNTP, der mit effektiven radioaktiven Isotopen markiert ist, hinzugefügt (die Technologie der markierten ddNTP und die entsprechende Nachweistechnologie verbessern und iterieren sich ebenfalls kontinuierlich). Durch Gelelektrophorese und Autoradiographie kann die DNA-Sequenz des Testmoleküls basierend auf der Position des elektrophoretischen Bands bestimmt werden.

Sanger-Sequenzierung ist einfach zu bedienen, ausgereift in der Methode, mit einer längeren Leselänge und extrem hoher Genauigkeit. Es ist der Goldstandard für Sequenzierung und der internationale Goldstandard für die Analyse genetischer Sequenzen. Die großangelegte Sequenzierungstechnologie, die im Human Genome Project (HGP) verwendet wurde, das 1985 vorgeschlagen und 1990 offiziell gestartet wurde, basiert auf der Sanger-Methode.

Die Sanger-Sequenzierung zur Validierung von NGS kann effektiv die Qualität der NGS-Daten überwachen und technische Ergänzungen sowie Verbesserungen erreichen.

Ergebnisse der Validierung von Varianten der nächsten Generation Sequenzierung (NGS) durch Sanger-Sequenzierung. Verifizierte Basen sind schwarz hervorgehoben (A) homozygote Variante im PRNP-Gen Val129Met. (B) Heterozygote Variante im FGA-Gen Thr331Ala. (Zuzana Chyra Kufova et al., 2018)

Fallstudie zur Bestätigung der Next-Generation-Sequenzierung

Der folgende Artikel befasst sich hauptsächlich mit den Themen Genauigkeit und Zuverlässigkeit hinsichtlich der Ergebnisse der Erkennung von erblichen Krebsarten durch NGS Technologie. Es untersucht die Umstände, unter denen abweichende Ergebnisse aus der NGS-Sequenzierung eine weitere Bestätigung erfordern durch Sanger-Sequenzierung.

Titel: Sanger-Bestätigung ist erforderlich, um optimale Sensitivität und Spezifität bei der Panel-Testung der Next-Generation-Sequenzierung zu erreichen

Q: Welche Arten von Varianten wurden in der Studie mit der Sanger-Sequenzierung untersucht?

In dieser Studie, Sanger-Sequenzierung wurden für alle nicht-polymorphen Varianten durchgeführt, insgesamt 7845. Davon wurden 1,3% als identifiziert. NGS falsche Positive, die hauptsächlich in komplexen genomischen Regionen wie AT-reichen Regionen, GC-reichen Regionen, Sequenzen mit einzelnen Nukleotidwiederholungen und Pseudogenregionen lokalisiert sind. Die Validierung der experimentellen Ergebnisse wurde durch die Simulation eines Schwellenwerts für die Qualität mit null falschen Positiven durchgeführt, was eine Verringerung der falschen Positiven Raten, aber auch einen Rückgang der Sensitivität ergab. Daher ist zur Aufrechterhaltung der höchsten Sensitivität und Spezifität eine Bestätigung der durch NGS identifizierten Varianten durch Sanger-Sequenzierung erforderlich.

Wann ist die Validierung der Sanger-Sequenzierung notwendig während NGS-Panel-Testung?

Sanger-Sequenzierung Die Validierung ist erforderlich, wenn nicht-polymorphe Varianten erkannt werden durch NGS nicht die konservativen Qualitätsstandards, wie minimale Abdeckung und Heterozygotieverhältnis, für die Berichterstattung erfüllen. Darüber hinaus wird in komplexen Regionen wie AT-reichen Regionen, GC-reichen Regionen, einzelnen Nukleotidwiederholungssequenzen und Pseudogenregionen eine Sanger-Bestätigung empfohlen, um die Sensitivität und Spezifität zu erhöhen.

Q: Wie setzt man angemessene Qualitätsgrenzen für NGS-Panel-Tests?

Zunächst ist es hinsichtlich der Abdeckung wichtig, eine Mindestabdeckung von 100x sicherzustellen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Erkennungsergebnisse zu gewährleisten. Eine solche Abdeckung erfüllt angemessen die Anforderungen der Erkennung und mindert das Risiko von Fehlern, die aus unzureichender Abdeckung resultieren.

Zweitens, hinsichtlich des Heterozygotie-Verhältnisses ist es ratsam, den Schwellenwert für das Heterozygotie-Verhältnis bei Varianten mit höherer Heterozygotie moderat zu senken. Beispielsweise hilft das Festlegen des Heterozygotie-Verhältnisses auf 40 % oder mehr, mehr Varianteninformationen zu erfassen, wodurch die Nachweisempfindlichkeit erhöht wird.

Darüber hinaus wird bei der Auswahl von genomischen Regionen empfohlen, höhere Qualitätsgrenzwerte für bestimmte komplexe genomische Regionen wie AT-reiche Regionen, GC-reiche Regionen, Einzel-Nukleotid-Wiederholungssequenzen und Pseudogenregionen anzuwenden. Dies trägt zur Verbesserung der Erkennungsempfindlichkeit und -spezifität bei, während Störungen und Fehlurteile, die aus regionsspezifischen Eigenschaften resultieren, reduziert werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass die oben genannten Schwellenwerte auf empirischen Schlussfolgerungen basieren, die aus umfangreichen Stichprobendaten abgeleitet wurden, und keine unveränderlichen Standards sind. In praktischen Anwendungen ist Flexibilität bei der Anpassung und Optimierung dieser Schwellenwerte erforderlich, basierend auf spezifischen Stichprobenmerkmalen, experimentellen Bedingungen und Erkennungsanforderungen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Erkennungsergebnisse sicherzustellen.

Sanger-Sequenzierungsergebnisse widersprechen NGS-Sequenzierungsergebnissen.

Der grundlegende Prozess von Sanger-Sequenzierung Umfasst: Zuerst wird eine ausreichende Menge an DNA-Fragmenten aus dem Zielbereich durch konventionelle PCR angesammelt; als Nächstes werden die resultierenden DNA-Fragmente als Vorlagen für die Amplifikation mit ddNTPs verwendet, um eine Reihe von einzelsträngigen DNA-Fragmenten unterschiedlicher Längen zu erzeugen; schließlich wird die Sequenzierung durchgeführt. Es ist offensichtlich, dass die Genauigkeit der PCR-Amplifikation die endgültigen Sequierungsergebnisse direkt beeinflusst. Jede Abweichung während des anfänglichen PCR-Amplifikationsschrittes kann zu ungenauen Sequierungsergebnissen führen. Die Hauptfaktoren, die die Genauigkeit der PCR-Ergebnisse beeinflussen, sind die Spezifität und Genauigkeit der Amplifikationsprimer, was die entscheidende Bedeutung des Primer-Designs unterstreicht.

Im Allgemeinen sollte das Primer-Design den folgenden Prinzipien folgen:

(1) Die Primerlänge liegt typischerweise zwischen 18-27 bp; übermäßig lange Primer können dazu führen, dass die Verlängerungstemperaturen 74 °C überschreiten, was für Taq-DNA-Polymerase-Reaktionen ungeeignet ist.

(2) Der GC-Gehalt von Primern liegt typischerweise zwischen 40 % und 60 %, mit einem optimalen Bereich von 45 % bis 55 %. Sowohl ein übermäßig hoher als auch ein zu niedriger GC-Gehalt sind ungünstig für das Auslösen von Reaktionen. Der GC-Gehalt und die Tm-Werte der oberen und unteren Primer sollten nah beieinander liegen, wobei der Tm-Wert im Allgemeinen 5 °C nicht überschreiten sollte.

(3) Das 3'-Ende des Primers enthält normalerweise keine A-Base und sollte nicht mehr als drei aufeinanderfolgende Basen wie GGG oder CCC enthalten, da dies zu einem Ausfall der PCR-Reaktion führen kann.

(4) Die Basen des Primers sind vorzugsweise zufällig verteilt, und es sollten nicht vier aufeinanderfolgende komplementäre Basen zwischen dem Primer selbst und zwischen den Primern vorhanden sein.

(5) Verwenden Sie die UCSC In-Silico PCR-Abfrage, um die Spezifität der Primer zu bestätigen.

(6) Der Abstand zwischen der chromosomalen Position des Primers und der Nachweisstelle sollte zwischen 80 bp und 800 bp liegen.

Untersuchung von Abweichungen zwischen Sanger- und NGS-Sequenzierungsergebnissen

Bei der Behandlung von Fällen, in denen Sanger-Sequenzierung Die Ergebnisse weichen von denen ab, die über ... erzielt wurden. NGS Sequenzierung, nach einer vorläufigen Validierung der Zuverlässigkeit von NGS-Sequenzierungsdaten ist unsere primäre Empfehlung, eine gründliche Überprüfung der Spezifität der in der Sanger-Sequenzierung verwendeten Primer durchzuführen. Durch sorgfältige Prüfung der NGS-Daten ist es unerlässlich zu untersuchen, ob die Bindungsstellen der Sanger-Amplifikationsprimer SNVs aufweisen, da diese Varianten den Amplifikationsprozess stören und zu Abweichungen zwischen den Ergebnissen führen können. Sollten solche Variantenstellen identifiziert werden, wird eine Neugestaltung der Primer, die spezifisch für die betreffende Probe sind, notwendig, um die Inkonsistenz zwischen den Sanger- und NGS-Sequenzierungsergebnissen zu beheben.

Tatsächlich, abgesehen von seltenen Fällen, in denen SNV-Mutationen zu abnormen führen Sanger-Sequenzierung Ergebnisse, der menschliche Körper beherbergt eine Vielzahl von SNP-Stellen. Diese SNP-Stellen, die im Genom reichlich vorhanden sind, stellen die häufigste Form der vererbbaren Variation beim Menschen dar und umfassen über 90 % der bekannten Polymorphismen. In typischen Szenarien kann es eine SNP-Stelle pro fünfhundert bis eintausend Basenpaare geben, wobei ihre Gesamtzahl drei Millionen überschreitet. Daher kann das Vorhandensein dieser SNP-Stellen innerhalb von Primersequenzen ebenfalls Amplifikationsverzerrungen hervorrufen, wodurch die Genauigkeit der Sequenzierungsergebnisse beeinträchtigt wird. Insgesamt könnte das Problem der Primerbindungsverzerrungen bei der Sanger-Sequenzierung weit verbreitet sein und verdient erhebliche Aufmerksamkeit.

Daher muss bei der Gestaltung von Sanger-Primern bewusst darauf geachtet werden, potenzielle SNV- und SNP-Stellen proaktiv zu vermeiden. Um SNP-Stellen zu umgehen, ist es ratsam, die UCSC-Website auf das Vorhandensein solcher Stellen innerhalb der Primersequenzen zu überprüfen. In Fällen von Diskrepanzen zwischen Sanger und NGS Bei den Sequenzierungsergebnissen sollte besonderes Augenmerk darauf gelegt werden, ob die Primer mit den SNV-Regionen übereinstimmen.

Zusammenfassung

Es ist bemerkenswert, dass selbst die renommierte "Goldstandard"-Sanger-Nachweismethode in äußerst seltenen Fällen falsch positive und falsch negative Ergebnisse liefern kann. Obwohl solche Vorkommen selten sind, erfordern sie unsere größte Wachsamkeit. Daher ist in der Praxis keine einzelne Nachweismethode fehlerfrei. Um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Variantenerkennung zu gewährleisten, ist es ratsam, ein ergänzendes Spektrum von Nachweismethoden anzuwenden, um gemeinsam Probleme zu adressieren und die authentischste Darstellung von Variantenauftritten zu verfolgen.

Referenzen:

1. Mu W, Lu HM, Chen J, et al. Sanger-Bestätigung ist erforderlich, um optimale Sensitivität und Spezifität bei der Panel-Testung der nächsten Generation zu erreichen. J Mol Diagn2016 Nov;18(6):923-932. doi: 10.1016/j.jmoldx.2016.07.006. Epub 2016 Okt 6. PMID: 27720647.
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