Sanger-Sequenzierung: Einführung, Arbeitsablauf und Anwendungen

Was ist die Sanger-Sequenzierung?

Sanger-SequenzierungDie DNA-Sequenzierungsmethode basiert auf der selektiven Einfügung von kettenabbrechenden Dideoxynukleotiden während der in vitro-Replikation von DNA, geleitet durch die Aktion der DNA-Polymerase. Diese Technik wurde 1977 von Frederick Sanger und seinem Team entwickelt, daher der Begriff "Sanger-Sequenz". Entscheidend für die Sanger-Sequenzierung ist das Phänomen der Reaktionsbeendigung der DNA-Polymerase, die durch Dideoxynukleotidtriphosphate (ddNTPs) ausgelöst wird – ein Prinzip, das zur alternativen Bezeichnung der Technik als "Dideoxy-Terminierungssequenzierung" geführt hat. Diese Methode hat sich als effektiv und zuverlässig erwiesen und ist seit fast vier Jahrzehnten die am weitesten verbreitete Sequenzierungstechnik.

Der Sanger-Sequenzierung Die Methode, die auf einer Genauigkeitsrate von 99,99 % bei der Basisidentifikation basiert, gilt weithin als der "Goldstandard" zur Verifizierung von DNA-Sequenzen. Dazu gehören auch die DNA-Sequenzen, die zunächst entschlüsselt wurden mit Next-Generation-Sequenzierung Techniken. Das Humangenomprojekt beispielsweise nutzte Sanger-Sequenzierung zur Bestimmung der Sequenzen relativ kurzer Fragmente der menschlichen DNA, die jeweils 900 Basenpaare oder weniger umfassen. Diese Fragmente dienten als Bausteine für den Aufbau größerer DNA-Abschnitte, die wiederum zusammengesetzt wurden, um gesamte Chromosomen zu konstruieren.

Abbildung 1. Kettenabbruchreaktion in der Sanger-Sequenzierung. (Saini et al., 2023)

Sanger-Sequenzierungs-Workflow

Sanger-Sequenzierung besteht hauptsächlich aus der Bildung eines Reaktionssystems, der Amplifikation des Zielsegments, der Gelelektrophorese und dem Sequenzlesen. Der Prozess von Sanger-Sequenzierung besteht aus einem Set von vier separaten Reaktionen, die jeweils Folgendes umfassen: (1) die vier Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs), die für die normale DNA-Synthese entscheidend sind; (2) die Einbeziehung von vier unterschiedlichen Didoxyribonukleotidtriphosphaten (ddNTPs) in jedes Reaktionssystem. Da ddNTPs die erforderliche 3-OH-Gruppe für die Verlängerung nicht besitzen, terminieren die amplifizierten Oligonukleotide selektiv an G, A, T oder C. Für eine effektive Positionierung sind diese mit Fluoreszenz oder Isotopen markiert. (3) Das Zielfragment, DNA-Polymerase und Primer bilden das Reaktionssystem.

Anschließend dient das Zielfragment als Vorlage unter der Katalyse von DNA-Polymerase, die die DNA-Replikation von den Primern initiiert. Bei der Begegnung mit ddNTPs stoppt die Reaktion. Die folgende Gel-Elektrophorese zielt darauf ab, diese terminierenden Oligonukleotidfragmente zu trennen. Schließlich werden die Fragmente einem elektrischen Strom ausgesetzt, um die Bandbildung zu induzieren. Unter dem kombinierten Einfluss von elektrischem Strom und Gelwiderstand entstehen regelmäßige Bänder längs in gleichen Abständen, die unterschiedliche Sequenzlängen repräsentieren, wobei jedes einem A-T-G-C-Sequenz entspricht.

Abbildung 2. Allgemeiner Arbeitsablauf der Sanger-Sequenzierung

Es gibt drei Hauptschritte zu Sanger-Sequenzierung welche sind die folgenden:

DNA-Sequenz für die Kettenabbruch-PCR

Die interessierende DNA-Sequenz wird als Vorlage für eine spezielle Art von PCR verwendet, die als Kettenabbruch-PCR bezeichnet wird. Kettenabbruch-PCR funktioniert genau wie die Standard-PCR, jedoch mit einem wesentlichen Unterschied: der Zugabe von modifizierten Nukleotiden, die Dideoxyribonukleotide genannt werden. Im Verlängerungsschritt der Standard-PCR fügt die DNA-Polymerase dNTPs zu einem wachsenden DNA-Strang hinzu, indem sie die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der freien 3'-OH-Gruppe des letzten Nukleotids und dem 5'-Phosphat des nächsten katalysiert.

Größentrennung durch Gel-Elektrophorese

Im zweiten Schritt werden die kettenterminierten Oligonukleotide nach Größe durch Gelelektrophorese getrennt. Bei der Gelelektrophorese werden DNA-Proben in ein Ende einer Gelmatrix geladen, und es wird ein elektrischer Strom angelegt; DNA ist negativ geladen, sodass die Oligonukleotide zur positiven Elektrode auf der gegenüberliegenden Seite des Gels gezogen werden. Da alle DNA-Fragmente die gleiche Ladung pro Masseneinheit haben, wird die Geschwindigkeit, mit der sich die Oligonukleotide bewegen, nur durch die Größe bestimmt. Je kleiner ein Fragment ist, desto weniger Reibung erfährt es beim Durchgang durch das Gel, und desto schneller bewegt es sich. Infolgedessen werden die Oligonukleotide von klein nach groß angeordnet, indem das Gel von unten nach oben abgelesen wird.

Gel-Analyse und Bestimmung der DNA-Sequenz

Der letzte Schritt besteht einfach darin, das Gel zu lesen, um die Sequenz der eingegebenen DNA zu bestimmen. Da die DNA-Polymerase DNA nur in Richtung 5' zu 3' synthetisiert und dabei mit einem bereitgestellten Primer beginnt, entspricht jedes terminale ddNTP einem spezifischen Nukleotid in der ursprünglichen Sequenz (z. B. muss das kürzeste Fragment am ersten Nukleotid vom 5'-Ende enden, das zweitkürzeste Fragment muss am zweiten Nukleotid vom 5'-Ende enden usw.). Daher können wir durch das Lesen der Gelbänder von klein nach groß die 5' zu 3' Sequenz des ursprünglichen DNA-Strangs bestimmen.

Abbildung 3. Übersicht über die Sanger-Sequenzierung

Vorteile der Sanger-Sequenzierung

Sanger-Sequenzierung ist eine bewährte Methodik, die für ihre hohe Genauigkeit bekannt ist. Diese klassische Technik bestimmt sorgfältig die Reihenfolge der Basen in der DNA, insbesondere wenn sie auf relativ kurze DNA-Fragmente angewendet wird. Bekannt für ihre Robustheit, ist der einfache Mechanismus und der konsistente Prozess von Sanger-Sequenzierung führt zu einem hohen Maß an Zuverlässigkeit. Bei ordnungsgemäßer Bedienung liefert es beständige und reproduzierbare Ergebnisse.

Seine Anwendbarkeit ist breit und anpassungsfähig, was Projekte unterschiedlicher Größenordnungen erleichtert, die von der Sequenzierung einzelner Gene bis hin zu gesamten Genomen reichen. Daher findet es umfangreiche Anwendung in der Forschung, klinischen Diagnostik und anderen Bereichen. Im Vergleich zu bestimmten NGS sind die damit verbundenen Kosten für Geräte und Reagenzien beim Sanger-Sequenzieren deutlich niedriger. Daher ist es eine attraktive Option für Projekte mit begrenzten Budgets. Wenn es um die Sequenzierung langer DNA-Fragmente geht, Sanger-Sequenzierung zeigt eine überlegene Leistung im Vergleich zu einigen Nachfolgegenerationen. Dies ist entscheidend für Projekte, die die Sequenzierung vollständiger Gene oder spezifischer Regionen erfordern.

Anwendungen der Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-DNA-Sequenzierung wird häufig für Forschungszwecke eingesetzt, wie zum Beispiel (1) das Anvisieren kleinerer genomischer Regionen in einer größeren Anzahl von Proben, (2) die Sequenzierung variabler Regionen, (3) die Validierung von Ergebnissen aus NGS-Studien, (4) die Überprüfung von Plasmidsequenzen, Einsätzen, Mutationen, (5) HLA-Typisierung, (6) Genotypisierung von Mikrosatellitenmarkern und (7) die Identifizierung einzelner krankheitsverursachender genetischer Varianten.

Abbildung 4. Beispiele für Sequenzen. Eine gute Nukleinsäuresequenz. (Crossley et al., 2020)

Sanger-Sequenzierung ist auch heute noch entscheidend in vielen Forschungsbereichen.

In der Genomforschung ist dieser Prozess entscheidend für die Genlokalisierung und Klonierung, indem er Gene identifiziert, lokalisiert und die Genauigkeit geklonter Segmente überprüft. Auch wenn die Genomsequenzierung nicht mit der Geschwindigkeit von NGS Technologien, Sanger-Sequenzierung hält sich gut, wenn es um die Sequenzierung kleiner Genome oder spezifischer Genregionen geht. Es erweist sich auch als hilfreich bei der Erkennung von Mutationen wie Einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNP) sowie Einfügungen oder Löschungen. In der molekularen Evolution, Sanger-Sequenzierung wird zur Artenidentifikation verwendet, indem die Gensequenzen bekannter Arten verglichen werden, um die Phylogenie unbekannter Arten zu bestimmen. Durch die Sequenzierung der DNA verschiedener Arten können wir die Verwandtschaft und die evolutionäre Geschichte vieler Arten aufdecken. Darüber hinaus erweist es sich als entscheidend in der medizinischen Diagnostik zur Identifizierung genetischer Variationen, die mit genetischen Erkrankungen in Zusammenhang stehen, und zur Erkennung von Onkogenmutationen in Tumorzellen, um die Behandlung zu steuern.

Im Agrar- und Umweltschutzsektor wird es zur Rassenidentifikation verwendet, indem die Sorten oder Verwandtschaft von Pflanzen und Tieren bestimmt werden. Auch die Analyse von Umwelt-DNA, die durch Sequenzierung von DNA in Umweltproben durchgeführt wird, gibt Einblick in die Biodiversität und die Gesundheit ökologischer Systeme. Forensische Anwendungen von Sanger-Sequenzierung werden in der persönlichen Identifikation durch die Sequenzierung der DNA von Individuen zur gerichtlichen Identifikation und persönlichen Wiedererkennung gesehen. Die DNA-Fingerabdruckidentifikation, die diese Methode nutzt, unterstützt die Analyse von DNA-Beweisen in Strafsachen und die Bestätigung der Identität eines Verdächtigen. Darüber hinaus umfassen aufkommende Anwendungen die Einzelzell-Sequenzierung in Verbindung mit Einzelzelltechnologien zur Erforschung der Genexpression und Mutation einzelner Zellen. Das Gebiet der Epigenetik zeichnet sich aus Sanger-Sequenzierung bei der Identifizierung epigenetischer Marker wie DNA-Methylierung oder Histonmodifikation, um tiefere Einblicke in die epigenetische Regulation zu gewinnen. In der synthetischen Biologie wird es verwendet, um die Genauigkeit und Funktion synthetischer DNA-Sequenzen zu überprüfen.

Einschränkungen der Sanger-Sequenzierung

Eingeschränkter Anwendungsbereich: Der Sanger-Sequenzierung Die Methode eignet sich nicht ideal für die Analyse längerer DNA-Sequenzen oder für großangelegte Sequenzierungsprojekte. Aufgrund ihrer Komplexität und Kosten ist sie eher für kleinere Projekte mit festgelegten Zielen geeignet.

Eingeschränkte Sequenzlänge: Die Länge der Sequenzen, die Sanger-Sequenzierung Die Decodierung ist durch die spezifischen Dideoxynukleotidtriphosphate (ddNTPs) eingeschränkt, die während des Reaktionsprozesses verwendet werden. Dies erfordert mehrere Reaktions- und Analyse-Runden für die Sequenzierung langer Fragmente, was wiederum die Arbeitsbelastung und die Zeitkosten erhöht.

Niedrige Durchsatzrate: Im Vergleich zu bestimmten NGS-Technologien, Sanger-Sequenzierung hat eine relativ niedrigere Durchsatzrate. Folglich können weniger Sequenzen innerhalb desselben Zeitrahmens abgeschlossen werden, was es für umfangreiche Sequenzierungsprojekte ungeeignet macht.

Manuelle Bedienung beeinflusst die Genauigkeit: Die Analyse der Gelelektrophorese und die Interpretation von Sequenzchromatogrammen, integrale Bestandteile des Sanger-Sequenzierungsprozesses, erfordern häufig manuelle Eingriffe. Dies führt zu potenziellen subjektiven Urteilen und Bedienfehlern, die wiederum die Genauigkeit des Sequenzierungsergebnisses beeinträchtigen können.

Sanger-Sequenzierung und NGS-Vergleich

Im Diskurs über Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung, wir sprechen implizit über die Entwicklung und den Fortschritt in den DNA-Sequenzierungstechniken. Die Sanger-Sequenzierung, eine frühe Sequenzierungstechnik, wurde für ihre Zuverlässigkeit und Präzision gelobt. Dennoch sind mit dem Fortschritt der Wissenschaft NGS-Technologien entstanden, die die Entwicklung im Bereich der DNA-Sequenzierung erheblich vorangetrieben haben. Es gibt auffällige Unterschiede zwischen Sanger-Sequenzierung und NGS Technologien in Aspekten wie ihren Prinzipien, Durchsatz, Geschwindigkeit, Kosten, Anwendungsbereichen und Datenanalyse.

Prinzipien und Techniken:

Das Sanger-Verfahren verwendet die Kettenabbruchmethode. Diese Technik nutzt di-Deoxy-Kettenabbrecher, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben markiert sind, wodurch die Einfügung einer spezifischen Base an jeder Position des DNA-Strangs ermöglicht wird.

NGS Technologien stellen eine Reihe von aufkommenden Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden dar, die großflächige massiv parallele DNA-Sequenzierung ermöglichen. Diese Techniken, einschließlich Illumina, Ion Torrent, PacBio und anderer, erlauben die gleichzeitige Sequenzierung zahlreicher DNA-Fragmente, was die Sequenzierungsgeschwindigkeit und -effizienz erheblich steigert.

Durchsatz und Geschwindigkeit:

Sanger-Sequenzierung ist im Allgemeinen auf die Verarbeitung einer bescheidenen Anzahl von DNA-Fragmenten beschränkt, mit einer relativ langsameren Geschwindigkeit. Im Gegensatz dazu erreichen NGS-Techniken eine höhere Durchsatzrate und Geschwindigkeit, die in der Lage sind, gleichzeitig Hunderte von Millionen bis Milliarden von DNA-Fragmenten zu verarbeiten und eine vollständige genomische Sequenzierung in deutlich verkürzter Zeit zu erreichen.

Kosten:

Sanger-Sequenzierung tendiert dazu, relativ teuer zu sein, insbesondere im Hinblick auf großangelegte Sequenzierungsprojekte. NGS Technologien erweisen sich unterdessen als kosteneffizienter, da sie in der Lage sind, eine Vielzahl von DNA-Fragmenten gleichzeitig zu sequenzieren, wodurch die Kosten pro Fragment gesenkt werden.

Anwendungsbereich:

Sanger-Sequenzierung ist typischerweise an kleineren Sequenzierungsprojekten beteiligt, wie der Sequenzierung einzelner Gene oder spezifischer DNA-Regionen. NGS Technologien finden umfangreiche Anwendungen in verschiedenen Bereichen, einschließlich Genomik, Transkriptomik und Epigenomik, und ermöglichen eine großflächige, tiefgehende und hochauflösende DNA-Sequenzierung.

Datenanalyse:

Das bescheidene Datenvolumen macht die Analyse relativ einfach für Sanger-Sequenzierung. Allerdings ist das erheblich größere Datenvolumen, das erzeugt wird durch NGS gewöhnlich erfordert dies komplexe bioinformatische Werkzeuge und Algorithmen zur Verarbeitung und Interpretation.

Tabelle 1 Vergleich der Vor- und Nachteile von Sanger-Sequenzierung und NGS

Jeder dieser Sequenzierungsansätze, einschließlich Sanger-Sequenzierung, Next-Generation-Sequenzierungund die Sequenzierung der dritten Generation hat ihre eigenen Vor- und Nachteile. Es ist ratsam, die Methode auszuwählen, die am besten zum Forschungsziel und zur untersuchten Probe passt.

Referenzen:

1. Crossley BM, Bai J, Glaser A, et al. Richtlinien für Sanger-Sequenzierung und Überwachung molekularer Tests. Zeitschrift für Veterinärdiagnostische Untersuchung. 2020 Nov;32(6).
2. Mardis ER. DNA-Sequenzierungstechnologien: 2006–2016. NaturprotokolleFeb 2017;12(2).
3. Saini M K, Gaurav H B, Kumar J, et al. DNA-Sequenzierungstechniken: Von Sanger bis zur Next-Generation-Sequenzierung. DNA, 2023, 3(09): 2378-2393.
4. Crossley B M, Bai J, Glaser A, et al. Richtlinien für Sanger-Sequenzierung und Überwachung molekularer Tests. Zeitschrift für Veterinärdiagnostische Untersuchung, 2020, 32(6): 767-775.