Überblick über HLA-Typisierung basierend auf Next Generation Sequencing

Hochauflösende HLA-Testung

Obwohl die Sanger-Sequenzierung derzeit die Hauptmethode für HLA-Typisierung ist und in HLA-Gewebematching-Labors und klinischen Krankenhäusern eingesetzt wird, sind die geringe Durchsatzrate und der zeitaufwendige Prozess die Hauptnachteile. Zweitens erfordert die Isolierung von HLA-Allelsequenzen in heterozygoten Proben durch die Sequenzierung der ersten Generation ebenfalls einen komplexeren und kostspieligeren Ansatz. Die Next-Generation-Sequenzierung wird aufgrund des dramatischen Anstiegs von Durchsatz und Geschwindigkeit sowie der Fähigkeit, vollständige Phasen abzuschließen, schnell breiter eingesetzt. Hochauflösende HLA-Typisierung in einem einzigen Schreibvorgang.

Die Probenhybridisierungs-Capture-basierte Next-Generation-Sequenzierung ermöglicht eine hochdurchsatzfähige und kostengünstige hochauflösende HLA-Typisierung. Die hohe Toleranz gegenüber Sequenzpolymorphismen ist ein herausragender Vorteil der Hybridisierungs-Capture-Technologie gegenüber der PCR-basierten Anreicherung von Zielsequenzen.

Mit der Entwicklung der molekularen Technologie und der Verbesserung der modernen medizinischen Bedürfnisse hat sich die HLA-Typisierungstechnologie von serologischen und zytologischen Typisierungen mit niedrigerer Auflösung und Genauigkeit zu Genotypisierungen mit höherer Auflösung und Genauigkeit entwickelt.

Es gibt vier gängige HLA-Genotypisierungen:

PCR-SSP (PCR mit sequenzspezifischen Primern)

PCR-SSOP (PCR mit sequenzspezifischen Oligonukleotid-Sonden)

SBT (Sequenzierungsbasiertes Typing)

NGS (Typisierung basierend auf Next-Generation Sequencing)

Anwendung von Next-Generation Sequencing in der HLA-Typisierung

Die Anwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur HLA-Typisierung ist in 3 Phasen unterteilt: (1) Sequenzierung und Typisierung der polymorphen HLA-Regionen; (2) Langstrecken-PCR-Sequenzierung und Typisierung des gesamten HLA-Gens oder ganzer Exons; (3) Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung (SMRT) mit Lesevorteil für die direkte Sequenzierung und Typisierung von HLA-I und (oder) HLA-II. Die ersten beiden Phasen werden mit dem 454-System, PGM und MiSeq/HiSeq durchgeführt, während die dritte Phase hauptsächlich mit dem SMRT-Sequenzer von Pacific Biosciences erreicht wird.

Das 454-Sequenzierungssystem wurde erstmals für HLA-Typisierung verwendet, und das Prinzip ist die Pyrophosphat-Sequenzierung. Die Leselänge hat sich von 100-150 bp auf 700 bp erhöht, und der Hauptvorteil ist die schnelle Sequenzierungsgeschwindigkeit und die lange Leselänge.

Der Vorteil der Leselänge ist entscheidend für die Erzeugung hochauflösender, genauer Ergebnisse und reduziert die unsicheren Ergebnisse im Vergleich zu SBT erheblich.

2. PGM-Sequenzierung ist eine kostengünstige und schnelle Next-Generation-Sequenzierungstechnologie, aber ihre kurze Leselänge (etwa 400 bp) macht die Datenanalyse relativ schwierig. Aus aktuellen Studien geht hervor, dass PGM trotz der Einschränkungen durch die Leselänge immer noch qualitativ hochwertige Ergebnisse in kurzer Zeit erzielen kann, basierend auf der Typisierung nach der Vollsequenzierung von HLA oder der Typisierung konventioneller polymorpher Exons durch Sequenzierung. Das drängende Problem besteht darin, die Datenverarbeitungssoftware zu verbessern oder zu entwickeln.

3. Das MiSeq/HiSeq-Sequenzierungssystem verwendet eine reversible Terminierungs-Sequenzierungstechnologie für die Sequenzierung durch Synthese. Im Vergleich zu anderen Next-Generation-Sequenzierungen ist HiSeq kostengünstiger, hat eine höhere Durchsatzrate (600 G/Lauf) und sequenziert schnell. Es ist in Bezug auf Durchsatz, Kosteneffizienz, Auflösung und Typisierungsgeschwindigkeit dem SBT-Verfahren weit überlegen. Im Vergleich zu PGM erzielt MiSeq einen hohen Durchsatz, eine niedrige Fehlerquote und eine kürzere Zeit.

4. SMRT hat die Vorteile einer schnellen Geschwindigkeit und einer langen Ausgabesequenz, aber die Fehlerquote bei der Sequenzierung ist hoch.

Der im April 2013 eingeführte RSII-Sequenzer hat eine durchschnittliche Lese-Länge von 3000 bp, die eine hochauflösende Typisierung ermöglicht und vollständige HLA-Gen-Sequenzen liefert. Mit dem Fortschritt der Technologie könnte SMRT auch die Lese-Länge auf 20 kb erhöhen, was das Problem der Mehrdeutigkeit bei der Typisierung angemessen lösen kann. In naher Zukunft wird die SMRT-Technologie die HLA-Typisierungstechnologie basierend auf der Next-Generation-Sequenzierung revolutionieren.

In Bezug auf die HLA-Typisierung wurde zunächst das 454-System verwendet, während Illuminas HiSeq mit seiner hohen Datenausgabe und den wirtschaftlichen Kosten eine wichtige Position im Bereich einnimmt. MiSeq/HiSeq und PGM sind derzeit die am häufigsten verwendeten Sequenzierungstypisierungsplattformen, während SMRT und das 454-System den Vorteil langer Reads haben, wobei SMRT das Potenzial hat, später die Oberhand zu gewinnen.

Hochdurchsatz-NGS-Workflow (PLoS ONE 11(10) 2016).

Merkmale der HLA-Typisierung basierend auf der Next-Generation-Sequenzierungstechnologie

Neben hoher Durchsatzrate, kurzer experimenteller Zykluszeit und geringen Kosten bietet die HLA-Typisierung basierend auf der Next-Generation-Sequenzierungstechnologie folgende Vorteile:

1. Hochauflösende Tipp-Ergebnisse

Die hochauflösende HLA-Typisierung ist entscheidend, um den Erfolg von Transplantationen zu verbessern und die Inzidenz von Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit zu reduzieren. Vor dem Aufkommen der Next-Generation-Sequenzierung gab es zwei Möglichkeiten, um hochauflösende Ergebnisse zu erzielen: (1) nach Erhalt von Ergebnissen mit niedriger Auflösung geeignete Sonden oder Primer auswählen, um hochauflösende Typisierungen zu erhalten; (2) nach der Typisierung mit der SBT-Methode die unsicheren Ergebnisse mit den Methoden PCR-SSP oder PCR-SSO bestätigen, um genaue, hochauflösende Typisierungen zu bestimmen. Die Next-Generation-Sequenzierungsmethode, die der SBT-Methode ähnlich ist, ist die genaueste und direkteste Typisierungsmethode, um hochauflösende Ergebnisse zu erzielen, und kann die mehrdeutigen HLA-Typisierungsergebnisse bei der SBT-Typisierung auflösen.

2. Lösung des Mehrdeutigkeitsproblems

Der Prozentsatz der mehrdeutigen Ergebnisse für HLA-A und B, die auf der SBT-Methode basieren, kann 76,31 % und 91,08 % erreichen, was einen wichtigen Nachteil der HLA-Typisierungs-Goldstandardmethode SBT darstellt. Es gibt zwei Mechanismen zur Erzeugung mehrdeutiger Ergebnisse: (1) Phasenmehrdeutigkeit. Wenn die HLA-Genstelle des Probenmaterials heterozygot ist, können die Sequenzen unterschiedlicher Allelkombinationen die Ergebnisse derselben Typisierungskombination präsentieren. (2) Die Basissequenzen des konventionellen Detektionsbereichs sind identisch, und die allelische Diversität befindet sich außerhalb des Sequenzierungsbereichs. Die Lösungen umfassen die Verwendung von SBT mit PCR-SSO SSP, die Sequenzierung des Bereichs außerhalb des konventionellen Detektionsbereichs von HLA oder die Sequenzierung nach der Trennung der beiden Allele, aber diese Methoden sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv.

Die HLA-Typisierung basierend auf Next-Generation-Sequencing kann dieses Problem effektiv vermeiden: (1) Die Fragmentierung von Genen amplifiziert und sequenziert einzelne DNA-Fragmente, wodurch die Kopplungsphase des Polymorphismus effektiv erfasst wird; (2) Das massiv parallele Sequenzieren ermöglicht es, dass jede Reaktionsrunde eine große Anzahl von Exons, Introns und sogar vollständigen HLA-Gen-Sequenzierungsergebnissen aus verschiedenen Genstandorten (oder verschiedenen Proben) produziert, die zur genauen Typisierung verwendet werden können.

Darüber hinaus wird mit der Entdeckung immer neuer Allele die Vielfalt und der Anteil von Kombinationen mehrdeutiger Ergebnisse zunehmen, was auch die Verwendung von Next-Generation-Sequencing für die HLA-Typisierung vorantreiben wird.

3. Whole-Exom/Whole-Genom-Sequenzierungstypisierung

Die konventionelle Sequenzierungstypisierung konzentriert sich auf die polymorphen Regionen der HLA-Gene, d.h. auf die Exons 2 und 3 der HLA-Klasse-I-Gene und das Exon 2 der HLA-Klasse-II-Gene. Aus Kosten- und technischen Gründen verfügen nur etwa 10 % der benannten Gene in der IMGT/HLA-Datenbank über vollständige HLA-Gensequenzen.

Mit der Weiterentwicklung der HLA-Typisierungsmethoden durch Next-Generation-Sequencing und der Senkung der Sequenzierungskosten wird zunehmend über die HLA-Whole-Exome- oder Whole-Genome-Sequenzierung berichtet. Diese Methode ist vorteilhaft für die Entdeckung neuer HLA-Allelvarianten, die Auflösung von Mehrdeutigkeiten und die Erlangung einer ultra-hohen Auflösung, die die Datenbank IMGT/HLA und die Knochenmarktransplantation bereichern kann. Zudem erleichtert sie das Studium der HLA-Polymorphismus und der molekularen Evolution in der Bevölkerung und bietet große Vorteile für zukünftige wissenschaftliche Forschungen und klinische Arbeiten.

Die Mängel der HLA-Typisierung durch Next-Generation-Sequencing

Bevor diese Anwendung jedoch populär wird, bestehen folgende Hindernisse: (1) Obwohl die Leistung der Next-Generation-Sequenzierungsmethode im Vergleich zu anderen Methoden erheblich verbessert wurde, ist es zweifellos ein arbeitsintensives, material- und finanzaufwendiges Projekt, eine großangelegte HLA-Ganzgenomsequenz zu erhalten; (2) die Betriebsspezifikationen für die HLA-Ganzgenom- oder Ganzexomsequenzierung durch Next-Generation-Sequenzierung müssen schrittweise verbessert werden; (3) Die Ganzgenomsequenzierung wird zwangsläufig eine große Anzahl neuer HLA-Allel entdecken, und Fragen wie deren Benennung und Bestätigung sowie die Integration und den Austausch massiver Informationen müssen berücksichtigt werden.

Das Aufkommen neuer Technologien bringt neben offensichtlichen Vorteilen auch bestimmte Einschränkungen mit sich. Die Mängel der HLA-Typisierung durch Next-Generation-Sequencing liegen hauptsächlich in: (1) der kurzen Leselänge, die das Hauptengpass der Next-Generation-Sequencing-Technologie darstellt und bestimmte Schwierigkeiten bei der späteren Genomassemblierung mit sich bringt. Erfreulich ist, dass die SMRT-Leselänge dennoch effizient für die HLA-Typisierung erreicht werden kann; (2) hohen Anforderungen an die Datenanalyse und Software. Entsprechend sind eine Reihe ausgezeichneter Datenverarbeitungssoftware entstanden, wie Omixon Target HLAE201, NGSengine, HLAreporter, Op-tiType usw.

Fazit

Als klassische HLA-Genotypisierungstechnologie ist PCR-SBT/SSP/SSO nach wie vor die international führende Methode, aber die HLA-Typisierung durch Next-Generation-Sequencing hat offensichtliche Vorteile in Bezug auf hohe Durchsatzrate, hohe Auflösung, Auflösung von mehrdeutigen Typisierungsergebnissen und Entdeckung neuer Allele. Mit der Entwicklung der Technologie und der Verbreitung der Anwendung verdienen groß angelegte Kontrollversuche unter verschiedenen Next-Generation-Sequencing-Plattformen; Verbesserungen des Benennungssystems und die Etablierung von Informationsaustauschplattformen; die Entwicklung und Bewertung von Datenverarbeitungssoftware sowie die Entwicklung standardisierter Betriebsprotokolle in zukünftigen Forschungen weitere Aufmerksamkeit. Aufgrund der Komplexität von HLA-Molekülen erscheint die Beschreibung der HLA-Diversität in der Bevölkerung und die Erforschung evolutionärer Mechanismen relativ schwierig. HLA-Typisierungsstudien, die auf Next-Generation-Sequencing basieren, bieten Vorteile für die Einrichtung groß angelegter Knochenmarkbibliotheken, hoch effiziente Matching-Arbeiten und die Untersuchung der HLA-Genstruktur und molekularen Funktion, was zur weiteren Entwicklung der HLA-Forschung und -Anwendungen führen wird.

Referenzen:

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