Sanger-Sequenzierung vs. Next-Generation-Sequenzierung (NGS)

Einführung

Innerhalb der Sphäre von DNA-Sequenzierungzwei bahnbrechende Methoden - Sanger-Sequenzierung und Next-Generation Sequencing (NGS) - haben die biologischen Wissenschaften transformiert. Jede dieser Techniken basiert auf unterschiedlichen Prinzipien und wird in einer Vielzahl von einzigartig passenden Rollen in der Forschung angewendet. Beide haben ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen. Das Verständnis der Unterschiede zwischen Sanger-Sequenzierung und NGS ist für Wissenschaftler und Kliniker von entscheidender Bedeutung, da es die Gestaltung des experimentellen Designs, die Interpretation der abgeleiteten Daten und letztendlich die Gesamtergebnisse der durchgeführten Forschung stark beeinflusst. Dieser diskursive Beitrag beginnt mit einem explorativen Vergleich der Sanger-Sequenzierung und NGS, untersucht deren jeweilige Vorteile, die Einschränkungen, die sie mit sich bringen, und den Kontext, in dem diese Anwendungen angemessen eingesetzt werden.

Unterschiede zwischen NGS und Sanger-Sequenzierung

Betriebsprinzip

Sanger-Sequenzierung, bekannt als Kapillarelektrophorese-Sequenzierung, funktioniert durch die Integration von fluoreszenzmarkierten Dideoxynukleotiden (ddNTPs) während der DNA-Synthese. Jedes ddNTP stoppt die Verlängerung des DNA-Strangs an präzisen Nukleotidstandorten und erleichtert die Bestimmung der DNA-Sequenz durch Kapillarelektrophorese.

Im Gegensatz dazu, NGS nutzt eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich reversibler Terminator-Chemie, Echtzeit-Einzelmolekül-Sequenzierung und nanoporenbasierter Sequenzierung, um Hochdurchsatz-Sequenzierung zu erreichen.

Durchsatz und Skalierbarkeit

Das Markenzeichen von NGS liegt in ihrem bemerkenswerten Durchsatz und ihrer Skalierbarkeit. NGS-Plattformen zeigen die Fähigkeit, eine Vielzahl von DNA-Fragmenten innerhalb eines einzigen Betriebszyklus zu sequenzieren, wodurch eine umfangreiche genomische Abdeckung und gleichzeitige Analysen von Hunderten bis Tausenden von Genen oder Genregionen ermöglicht werden. Dieses Merkmal übertrifft deutlich den begrenzten Durchsatz, der in der Sanger-Sequenzierung inherent ist, die konventionell DNA-Fragmente seriell, eines nach dem anderen, verarbeitet.

Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

NGS bietet eine überlegene Empfindlichkeit im Vergleich zu Sanger-Sequenzierunginsbesondere bei der Erkennung von niedrigfrequenten Varianten und seltenen Mutationen. Die Tiefensequenzierungskapazität von NGS ermöglicht die Identifizierung subtiler genetischer Variationen, die in Frequenzen von bis zu 1 % vorhanden sind. Im Gegensatz dazu kann die Sanger-Sequenzierung eine geringere Sensitivität aufweisen, mit einer Nachweisgrenze, die typischerweise bei etwa 15-20 % liegt.

Entdeckungsenergie

NGS zeichnet sich durch die Offenlegung neuartiger Varianten und genetischer Enthüllungen aus, die auf seine Hochdurchsatzkapazität und umfassende Genomabdeckung zurückzuführen sind. Wissenschaftler, die NGS-Technologie nutzen, können bisher unbemerkte genetische Variationen aufdecken und ein tieferes Verständnis für genetische Komplexität und Vielfalt erlangen. Obwohl Sanger-Sequenzierung hält Präzision und Zuverlässigkeit aufrecht, könnte jedoch im Bereich der Entdeckungsstärke, die von NGS-Plattformen geboten wird, hinter den Erwartungen zurückbleiben.

Vergleich zwischen Sanger-Sequenzierung und NGS-Technologien.

Vorteile von Sanger gegenüber Illumina

Schnelle und kosteneffektive Sequenzierung für Zielgene mit niedriger Anzahl:

Sanger-Sequenzierung bleibt eine praktikable Option für die Sequenzierung einer begrenzten Anzahl von Zielen, wie einzelnen Genen oder kurzen DNA-Fragmenten. Ihre Vertrautheit, Robustheit und Kosteneffizienz machen sie geeignet für kleine Sequenzierungsprojekte, die hohe Genauigkeit und Spezifität erfordern. Darüber hinaus kann die Sanger-Sequenzierung ohne die Notwendigkeit komplexer Bibliotheksvorbereitungsmaßnahmen durchgeführt werden, was einen unkomplizierten Arbeitsablauf bietet.

Vertrauter Arbeitsablauf und höhere Sequenzierungstiefe:

Sanger-Sequenzierung präsentiert einen Arbeitsablauf, der vielen Forschungslaboren vertraut ist und sich über die Zeit fest etabliert hat. Forscher, die im Sanger-Sequenzieren versiert sind, können dessen Vorteile für das gezielte Sequenzieren präziser genomischer Regionen oder Gene nutzen. Darüber hinaus kann das Sanger-Sequenzieren eine verbesserte Sequenzierungstiefe erreichen, wodurch eine erhöhte Sensitivität bei der Erkennung von Varianten, die in niedrigen Frequenzen auftreten, ermöglicht wird.

Einschränkungen von Sanger im Vergleich zu Illumina

Begrenzter Durchsatz und Skalierbarkeit:

Trotz seiner bemerkenswerten Genauigkeit und Zuverlässigkeit, Sanger-Sequenzierung wird durch verringerten Durchsatz und Skalierbarkeit im Vergleich zu Technologien der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) beeinträchtigt. Die arbeitsintensiven Protokolle, die dem Sanger-Sequenzierungsverfahren innewohnen, beschränken dessen Nützlichkeit bei großangelegten Sequenzierungsprojekten, die einen erhöhten Proben-Durchsatz erfordern. Darüber hinaus nimmt mit der Zunahme der Zielmoleküle die Kosteneffizienz der Sanger-Sequenzierung ab, was sie weniger geeignet für umfassende genomische Analysen macht.

Erhöhte Kosten für Hochvolumenziele:

Sanger-Sequenzierung kann exorbitante Kosten verursachen, wenn es darum geht, eine beträchtliche Anzahl von Zielen (>20) zu sequenzieren, da jede Zieltyp normalerweise individuelle Sequenzierungsreaktionen erfordert. Die kumulierten Ausgaben für Reagenzien, Arbeitsaufwand und Instrumentierung, die mit der Sanger-Sequenzierung verbunden sind, können ihre Vorteile in Bezug auf Präzision und etablierte Methodik übersteigen, insbesondere in Hochdurchsatzumgebungen.

Vergleich von Sanger-Sequenzierung und NGS

Sanger-Sequenzierung und NGS verkörpern divergente Methoden in DNA-Sequenzierung, die jeweils durch unterschiedliche Vorteile und Einschränkungen gekennzeichnet sind. Die Unterscheidung der relativen Vorzüge und Nachteile dieser Ansätze ist von entscheidender Bedeutung für die sorgfältige Auswahl von Sequenzierungsstrategien, die auf spezifische Forschungs- oder klinische Anforderungen zugeschnitten sind.

Durch die Abgrenzung der nuancierten Merkmale der Sanger-Sequenzierung und der NGS können Forscher die Feinheiten der Sequenzierungsmethoden mit informierter Präzision navigieren und ihre Wahl an die Anforderungen des jeweiligen Forschungs- oder klinischen Bereichs anpassen.

Vorteile von NGS gegenüber der Sanger-Sequenzierung

Verstärkte Sensitivität und Entdeckungsfähigkeit

Ein entscheidender Vorteil, der unterscheidet NGS von Sanger-Sequenzierung liegt in seiner verstärkten Sensitivität und Entdeckungsfähigkeit. NGS-Methoden, die durch ihr massiv paralleles Sequenzierungsparadigma gekennzeichnet sind, zeichnen sich dadurch aus, dass sie seltene oder niedrigfrequente genetische Varianten mit unvergleichlicher Tiefe erkennen. Diese erhöhte Sensitivität hat eine herausragende Bedeutung in Anwendungen, die die Offenlegung neuer Mutationen oder seltener genetischer Marker erfordern. Besonders im Bereich der Krebsforschung, wo subtile Mutationen den Krankheitsverlauf auslösen können, ermöglicht die erhöhte Sensitivität von NGS den Forschern, das gesamte Spektrum genetischer Veränderungen, die in Tumorgenomen verborgen sind, zu erfassen. Eine solche Sensitivität unterstützt Initiativen in der Präzisionsmedizin, indem sie die Identifizierung umsetzbarer genetischer Ziele erleichtert und somit personalisierte Behandlungsstrategien fördert.

Schnelle Durchlaufzeiten und Skalierbarkeit

NGS bietet einen auffälligen Vorteil in Bezug auf Durchlaufzeit und Skalierbarkeit im Vergleich zu Sanger-SequenzierungDurch ihre Fähigkeit, Millionen von DNA-Fragmenten in einem einzigen Vorgang gleichzeitig zu sequenzieren, verkürzen NGS-Plattformen erheblich die Zeit, die für die Erstellung umfassender genomischer Daten erforderlich ist. Dieser erhöhte Durchsatz hat eine besondere Bedeutung in Kontexten mit hohen Probenvolumina, wie zum Beispiel in großen Bevölkerungsstudien oder klinischen Diagnostikeinrichtungen, die täglich zahlreiche Proben verarbeiten. Darüber hinaus ermöglicht die Skalierbarkeit von NGS den Forschern, ihre Sequenzierungsprojekte nahtlos zu erweitern und Projekte unterschiedlicher Größenordnungen zu berücksichtigen, ohne die Effizienz oder Kosteneffektivität zu beeinträchtigen. Folglich hat sich NGS als die bevorzugte Methode für Vorhaben etabliert, die eine zügige Datenerfassung und -analyse in verschiedenen genomischen Bereichen erfordern.

Wann man NGS vs. Sanger-Sequenzierung verwenden sollte

Sanger-Sequenzierung: Fokussierte Analyse und Einzelgenuntersuchungen

Sanger-Sequenzierung beibehält seine zentrale Rolle als wertvolles Werkzeug für fokussierte Analysen und Einzelgenstudien, insbesondere in Kontexten, in denen Präzision und Zuverlässigkeit Vorrang haben. Dank seiner sorgfältig etablierten Protokolle und lobenswerten Genauigkeitsraten glänzt die Sanger-Sequenzierung in Szenarien, die die Sequenzierung einzelner Gene oder kurzer DNA-Fragmente erfordern. Darüber hinaus erweist sich die Sanger-Sequenzierung als wirtschaftlich tragfähig für Vorhaben, die eine begrenzte Anzahl von Zielen oder Proben umfassen, was sie gut geeignet für Studien im kleinen Maßstab oder diagnostische Tests macht, die sich auf spezifische genetische Loci konzentrieren. Darüber hinaus macht die Vertrautheit und Benutzerfreundlichkeit der Sanger-Sequenzierung sie für Labore unterschiedlicher Fachkenntnisse zugänglich, wodurch zuverlässige Ergebnisse in verschiedenen Forschungsumgebungen gewährleistet werden.

NGS: Hochdurchsatz-Genomik und umfassende Analyse

NGS entsteht als der bevorzugte Ansatz für Hochdurchsatz-Genomik und umfassende genomische Analysen und bietet unvergleichlichen Durchsatz und Abdeckung. Seine Fähigkeit, Hunderte bis Tausende von Genen gleichzeitig zu untersuchen, befähigt Forscher, komplexe biologische Systeme zu entschlüsseln und neuartige genetische Varianten über ganze Genome oder gezielte Regionen hinweg aufzudecken. Darüber hinaus macht die erhöhte Sensitivität und Skalierbarkeit der NGS-Technologie sie besonders geeignet für Anwendungen, die die Analyse verschiedener Probenarten oder umfangreicher Kohorten erfordern, wie beispielsweise genomische Studien im Bevölkerungsmaßstab oder klinische Studien. Durch die Nutzung der Möglichkeiten der NGS sind Forscher in der Lage, neue Erkenntnisse über die genetischen Grundlagen von Krankheiten zu gewinnen, was den Weg für Fortschritte in der Diagnostik, Therapie und personalisierten Medizin ebnet.

Beide Sanger-Sequenzierung und NGS spielen eine entscheidende Rolle im Bereich der Genomik und bieten verschiedene Vorteile und Anwendungen. Während das Sanger-Sequenzieren eine zuverlässige Wahl für gezielte Analysen und Einzelgenstudien bleibt, erweist sich NGS als transformative Technologie, die Hochdurchsatz-Genomik und umfassende genomische Analysen ermöglicht.

Anwendungen von NGS (Evelien M. Bunnik et al., 2012)

Illumina vs PacBio Sequenzierung

Illumina-Sequenzierung, ein Grundpfeiler von NGS Die Technologie hat einen Paradigmenwechsel in der genomischen Forschung ausgelöst, dank ihrer Hochdurchsatzfähigkeiten und Präzision. Ihre Nützlichkeit erstreckt sich über ein breites Spektrum, das von der gesamten Genomsequenzierung bis zur gezielten Ampliconanalyse reicht. Die weitverbreitete Akzeptanz von Illumina beruht auf ihrer Robustheit, Genauigkeit und Kosteneffizienz, was sie zur bevorzugten Wahl für großangelegte genomische Untersuchungen, populationgenetische Anfragen und klinische Diagnostik macht.

PacBio-SequenzierungUmgangssprachlich als Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequenzierung bekannt, bringt sie eine einzigartige Dimension in die genomische Analyse durch ihre Fähigkeit, lange Reads zu erzeugen. Im Gegensatz zu Illumina vermeidet die PacBio-Sequenzierung die Notwendigkeit der Template-Amplifikation, wodurch Verzerrungen und Fehler, die häufig mit PCR verbunden sind, gemildert werden. Durch die Überwachung der Echtzeit-Inkorporation von Nukleotiden bietet die PacBio-Sequenzierung beispiellose Einblicke in komplexe genomische Landschaften und erläutert strukturelle Variationen, repetitive Elemente und epigenetische Modifikationen.

PacBio vs Nanopore-Sequenzierung

PacBio-Sequenzierung zeichnet sich durch seine Fähigkeit aus, umfangreiche Reads zu generieren, die wertvolle Einblicke in strukturelle Variationen und die genomische Architektur bieten. Durch die Beobachtung des Sequenzierungsprozesses in Echtzeit liefert PacBio Reads, die sich über Tausende von Basenpaaren erstrecken, und ermöglicht so die genaue Charakterisierung komplexer genomischer Regionen. Diese Fähigkeit macht die PacBio-Sequenzierung unverzichtbar für verschiedene Anwendungen, einschließlich de novo Genomassemblierung, Haplotyp-Phasierung und Analyse des vollständigen Transkriptoms.

Nanoporen-Sequenzierung hebt sich aufgrund seiner Portabilität und Echtzeitanalysefähigkeiten hervor und bietet ein vielseitiges Werkzeug für die Feldforschung und Diagnostik am Ort der Versorgung. Durch das Durchqueren von DNA-Strängen über Nanoporen, die in Lipidmembranen eingebettet sind, erkennt die Nanopore-Sequenzierung Veränderungen in elektrischen Strömen, was eine direkte Bestimmung von Nukleotidsequenzen ermöglicht. Diese Technologie macht aufwendige Laboraufbauten überflüssig und erleichtert schnelle und vor Ort durchgeführte genomische Analysen. Die Anwendungen der Nanopore-Sequenzierung reichen von der Überwachung von Infektionskrankheiten über die Umweltüberwachung bis hin zur personalisierten Genomik und unterstreichen ihre breite Nützlichkeit in verschiedenen Bereichen.

Nanopore- vs. Illumina-Sequenzierung

Nanoporen-SequenzierungDie Portabilität und die Echtzeitanalysefähigkeiten ermöglichen es Forschern, genomische Untersuchungen in abgelegenen oder ressourcenbeschränkten Umgebungen durchzuführen. Durch den Einsatz tragbarer Geräte wie dem MinION können Forscher Sequenzierungsversuche außerhalb der herkömmlichen Laborgrenzen durchführen, was neue Wege für die Feldforschung und Diagnosen am Ort der Versorgung eröffnet. Die Fähigkeit von Nanopore, direkt lange Reads von DNA- oder RNA-Molekülen zu sequenzieren, bietet Vorteile in verschiedenen Bereichen, einschließlich de novo Assembly, Transkriptomik und Metagenomik.

Die Illumina-Sequenzierung, die sich durch ihre unübertroffene Durchsatzrate und Präzision auszeichnet, gilt als der Maßstab für großangelegte genomische Untersuchungen und klinische Diagnostik. Durch die Erzeugung von Millionen kurzer Reads in Parallel gewährleistet die Illumina-Sequenzierung eine umfassende Abdeckung des Genoms, was die Entdeckung von Varianten, die Profilierung der Genexpression und epigenetische Untersuchungen erleichtert. Ihre Robustheit und Kosteneffizienz haben sie in Bestrebungen, die hochauflösende genomische Daten erfordern, unverzichtbar gemacht, einschließlich Bereiche wie Krebsgenomik, Populationsgenetik und Forschung zu Infektionskrankheiten.

Zusammenfassend, Sanger-Sequenzierung und NGS Technologien wie Illumina, PacBio und Nanoporen-Sequenzierung bieten komplementäre Stärken in der genomischen Analyse. Die Nutzung der Fachkenntnisse von CD Genomics in diesen Sequenzierungsplattformen ermöglicht es Forschern, auf ein umfassendes Spektrum an genomischen Lösungen zuzugreifen, wodurch sie die Komplexität des Genoms erkunden und neue Wege in der biologischen Forschung und klinischen Diagnostik beschreiten können.

Referenzen:

1. Bunnik EM, Le Roch KG. Eine Einführung in die funktionelle Genomik und Systembiologie. Adv Wound Care (New Rochelle)2013
2. Andrew D. Young, Jessica P. Gillung Phylogenomik — Prinzipien, Möglichkeiten und Fallstricke der Big-Data-Phylogenetik. Systematische Entomologie 2019