Was ist DNA?
DNA, verwoben in einer Doppelhelixstruktur, die einer spiralförmigen Leiter ähnelt, dient als das grundlegende genetische Material aller lebenden Organismen. Es besteht aus vier chemischen Buchstaben—Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C)—und dieses molekulare Skript verknüpft 6 Milliarden Buchstaben (3 Milliarden Basen), die die Gesamtheit der Lebensinformationen enthalten.
Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist eine entscheidende Nukleinsäure, die die genetischen Anweisungen trägt, die für die RNA- und Proteinsynthese in lebenden Zellen von wesentlicher Bedeutung sind. Sie ist ein Biomolekül, das für die Entwicklung und das ordnungsgemäße Funktionieren von Organismen unerlässlich ist. Die Sequenz der Basen in den Nukleotiden der DNA bildet die Grundlage der genetischen Information. Diese Information wird transkribiert, um RNA zu erzeugen, und anschließend wird die mRNA darin translatiert, um Polypeptide zu erzeugen, die Proteine darstellen.
Die DNA-Replikation, ein Prozess, der der Zellteilung vorausgeht, gewährleistet die Bewahrung genetischer Informationen und verhindert deren Verlust über Generationen hinweg. Bei Eukaryoten befindet sich die DNA in Strukturen, die als Chromosomen im Zellkern bezeichnet werden. In Organismen ohne Zellkern ist die DNA in Chromosomen oder anderen Geweben vorhanden (Bakterien verfügen über einfach geschlungene, doppelsträngige DNA-Moleküle, während Viren DNA- oder RNA-Genome besitzen). Chromatinproteine wie Histone und Cohesine spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der geordneten Struktur der DNA innerhalb der Chromosomen. Diese Strukturen orchestrieren das Zusammenspiel zwischen dem genetischen Code und den für die Transkription verantwortlichen Proteinen und üben Kontrolle über die Genexpression aus.
Warum sich mit DNA-Sequenzierung beschäftigen?
- Die DNA-Sequenzierung dient dem Zweck, die Komplexität des Lebens zu entschlüsseln, die Unterschiede zwischen Organismen zu erforschen und die evolutionären sowie entwicklungsbiologischen Geschichten verschiedener Lebensformen zu untersuchen.
- Diese wissenschaftliche Technik spielt eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung von rekombinantem DNA.
- Darüber hinaus hat die DNA-Sequenzierung eine erhebliche praktische Bedeutung bei der Krankheitsdiagnose und Genotypisierung.
Was ist DNA-Sequenzierung?
Die DNA-Sequenzierungstechnologie steht an der Spitze der Genomik und gehört zu den am häufigsten eingesetzten und entscheidenden Technologien in den modernen Lebenswissenschaften.
Im Jahr 1953 enthüllten Watson und Crick nicht nur die Doppelhelixstruktur der DNA, sondern hoben auch die Bedeutung der Sequenzierung hervor, um die Reihenfolge der Basen in DNA-Molekülen zu entschlüsseln.
Die Entwicklung der Sequenziertechnologie hat vier verschiedene Phasen durchlaufen und vier Durchbrüche erzielt, beginnend mit "vor-direkter Lesung" über "direkte Lesung", von manuellen Prozessen zu Automatisierung, von plattengestützten Methoden zu kapillargelbasierter Elektrophorese (was die erste Realisierung von großangelegtem Sequenzieren markiert) und schließlich zur massiv parallelen Sequenzierung.
Die Hochdurchsatz-Sequenzierungs- und Langsequenzierungsplattformen von CD Genomics ermöglichen eine robuste Analyse von DNA/Genomen. Dieser fortschrittliche Sequenzierungsansatz erlaubt eine umfassende und effiziente Untersuchung genetischen Materials und liefert wertvolle Einblicke in die molekulare Landschaft sowie potenzielle Biomarker, die mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung stehen.
4 Meilensteine in der DNA-Sequenzierungstechnologie
Erster Durchbruch: Direkte Ablesung
- Vor-Direktlesung: Die ursprüngliche Sequenzierungsmethode vor der Direktlesung umfasste Techniken wie molekulare Klonierung, PAGE und radiografische Autoradiographie.
- SBC-Methode: Eine chemische Abbaureaktion, die spezifische Reagenzien verwendet, um DNA-Moleküle direkt abzubauen. Gilbert erhielt 1980 den Nobelpreis für Chemie für die Erfindung der SBC-Methode.
- SBS-Methode: Basierend auf enzymatischen Synthesereaktionen und DNA-Synthese, auch bekannt als die Sanger-Methode oder doppelte Desoxyribonukleinsäure-Terminalterminierungsmethode. Diese Methode bietet Vorteile wie ungiftige Reagenzien, einfache Handhabung, stabile Ergebnisse, hohe Genauigkeit und ausgezeichnete Reproduzierbarkeit.
Z Durchbruch: Automatisierung
- Pioniere der automatisierten Sequenzierung: Akiyoshi Wada, Wilhelm Ansorge.
- Der entscheidende Durchbruch bei der Automatisierung der SBS-Methode kam mit der Erfindung des automatisierten vierfarbigen fluoreszenzmarkierten SBS-Sequenziergeräts von Leroy Hood. Diese Innovation spielte eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung und dem Start des Humangenomprojekts (HGP).
Dritter Durchbruch: Skalierung
- Das Aufkommen und die Verbesserung der Kapillarelektrophorese-Sequenzierungstechnologie erleichterten die Skalierung.
- Im Jahr 1998 führte ABI den ABIPrism 3700 Kapillarsequenzierer (ABI3700) ein, der eine direkte Skalierung der Sequenzierungstechnologie ermöglichte. Die anschließende Einführung der MegaBACE-Serie von Sequenzierern trug erheblich zum frühen Abschluss des HGP bei.
V Durchbruch: Massiv parallele Sequenzierung
Dies stellt einen erheblichen Fortschritt dar, der durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, DNA in massiv paralleler Weise zu sequenzieren, was zu einer schnellen und gleichzeitigen Analyse mehrerer Fragmente führt. Eines der Hauptmerkmale des Sequenzierens ist sein erheblicher Beitrag zum drastischen Rückgang der Sequenzierungskosten.
Arten von DNA-Sequenzierungstechnologien
Die anfängliche Ära der DNA-Sequenzierungstechnologie basierte entweder auf der Strangterminierungsmethode, die 1975 von Sanger und Coulson eingeführt wurde, oder auf der chemischen Methode, die mit der Strangdegradation verbunden ist und von Maxam und Gilbert in den Jahren 1976-1977 entwickelt wurde. Diese Techniken werden zur Vereinfachung häufig als Sanger-Methode zusammengefasst. Ein entscheidender Moment trat 1977 ein, als Sanger erfolgreich die erste Genomsequenz bestimmte – konkret die des Phagen phiX-174, die aus nur 5.375 Basen besteht.
Vorteile |
Die Methode zeichnet sich durch einfache Handhabung, eine gut etablierte und ausgereifte Technik, hohe Genauigkeit und die Fähigkeit aus, längere Leselängen zu erzeugen. Sie findet breite Anwendung in verschiedenen Forschungsbereichen, insbesondere in kleinmaßstäbliches bakterielles Genom-SequencingPlasmid-Sequenzierung, Sequenzierung von Enden bakterieller künstlicher Chromosomen und Verifizierung von Mutationsstellen. |
Nachteile |
Trotz seiner Vorteile bringt der Ansatz Nachteile mit sich, wie hohe Kosten, begrenzte Durchsatzkapazität und eine bemerkenswerte Unfähigkeit, die Anforderungen von großangelegte GenomassemblierungDiese Einschränkungen sollten bei der Auswahl der Sequenzierungsmethode in Anbetracht der spezifischen Größe und Anforderungen der genomischen Analyse berücksichtigt werden. |
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Sanger-Sequenzierung: Einführung, Arbeitsablauf und Anwendungen.
Sanger-Sequenzierung Fragen und Antworten
- Next-Generation-Sequenzierung (NGS)
Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung und Verbesserung von Genomprojekten stieß die Sequenzierung der ersten Generation auf Einschränkungen hinsichtlich Durchsatz, Geschwindigkeit und Kosten, was sie ungeeignet machte für Großangelegte Sequenzierung Anforderungen wie Deep-Sequencing und Repeat-Sequencing. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, stellte das Aufkommen der Next-Generation-Sequencing einen transformativen Meilenstein dar. Über mehr als ein Jahrzehnt technologischer Evolution und Marktdynamik sind bahnbrechende Technologien wie Roche454 und ABI Solid, die einst strahlend leuchteten, allmählich aus dem Markt verschwunden.
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Derzeit wird die Landschaft von etablierten Herstellern von NGS-Geräten dominiert, darunter die Nextseq- und MiniSeq-Serien von Illumina (anerkannt als die globale Mainstream-NGS-Plattform) sowie die MGISEQ-Serie und DNBSEQ-Sequenzer von UWM. Bemerkenswert ist, dass die NGS-Plattform von UWM weiterhin eine wettbewerbsfähige Position einnimmt.
Der Fortschritt und die weitverbreitete Einführung dieser Technologien haben Forschungsanstrengungen in erheblichem Maße beschleunigt in Genomresequenzierung, großangelegte Genomsequenzierung, DNA-Methylierungssequenzierung, Transkriptom-Sequenzierung, gezielte Sequenzierung genomischer Regionen, Erkennung von epigenetischen Modifikationen von Genen, mikrobielle Identifikationund mehr. Besonders hervorzuheben ist, dass diese Innovationen die Herausforderungen, die mit den hohen Kosten und der niedrigen Durchsatzrate der Sequenzierungstechnologien der ersten Generation verbunden sind, effektiv angegangen sind. Ihre breite Anwendung erstreckt sich auf die Diagnostik von Krankheitserregern, präzise Medizin, klinische Tests und molekulare Pathologie und hat einen transformativen Einfluss auf verschiedene Bereiche.
Die Hochdurchsatz-Sequenzierungs- und Langsequenzierungsplattformen von CD Genomics ermöglichen eine robuste Analyse von DNA/Genomen. Dieser fortschrittliche Sequenzierungsansatz erlaubt eine umfassende und effiziente Untersuchung von genetischem Material und bietet wertvolle Einblicke in die molekulare Landschaft sowie potenzielle Biomarker, die mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung stehen.
In den letzten Jahren haben Forscher die Entwicklung der dritten Generation der Sequenzierungstechnologie vorangetrieben—Einzelmolekül-Echtzeit-SequenzierungDieser innovative Ansatz zielt darauf ab, DNA-Sequenzinformationen mit größerer Genauigkeit und Effizienz zu gewinnen. Im Gegensatz zu seinen Vorgängern beseitigt diese Technologie die Notwendigkeit einer PCR-Amplifikation und basiert auf der Erkennung elektrischer oder chemischer Signale von einzelnen DNA-Molekülen, was die Sequenzierung jedes DNA-Moleküls unabhängig ermöglicht.
Die aktuellen Favoriten in Langzeit-Sequenzierungsplattformen sind Oxford Nanopore und PacBio.
- Nanoporen-Sequenzierungstechnologie
Oxford Nanopore Technologies hat eingeführt Einzelmolekül-Nanoporen-DNA-Sequenzierung, zentriert auf der Sequenzierung elektrischer Signale. Das Prinzip umfasst den Durchgang eines einzelnen Basen- oder DNA-Moleküls durch einen Nanoporenkanal, was erkennbare Veränderungen der elektrischen Eigenschaften des Kanals verursacht. Die unterschiedlichen chemischen Eigenschaften der Basen A, T, C und G führen zu variierenden Änderungen der elektrischen Parameter während ihres Durchgangs durch die Nanopore. Die Erkennung dieser Veränderungen ermöglicht die Bestimmung des entsprechenden Basentyps, was letztendlich die Sequenz des DNA-Strangs offenbart. Bemerkenswert ist, Nanopore-Technologie zeichnet sich durch die direkte Erkennung einer größeren Anzahl von Basen aus, einschließlich Methylierungsstellen und verschiedenen Aminosäuren.
- PacBio Einzelmolekül-Echtzeit (SMRT) Sequenzierungstechnologie
PacBio RS Sequenzierungstechnologie, eine weit verbreitete Kerntechnologie in der Langzeit-Sequenzierung, basiert auf fluoreszierender Markierung während der Synthese. Das Prinzip besteht darin, die DNA-Vorlage mit einer Polymerase einzufangen, wobei vier verschiedene fluoreszierend markierte Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP) zufällig in den Detektionsbereich eintreten und durch Brownsche Bewegung mit der Polymerase interagieren. Basen, die mit der DNA-Vorlage übereinstimmen, bilden chemische Bindungen, was zu einer längeren Interaktionsdauer im Vergleich zu nicht übereinstimmenden Basen führt. Diese verlängerte Interaktion erleichtert die Anregung der fluoreszierend markierten dNTP und ermöglicht die Detektion der entsprechenden fluoreszierenden Signale. Durch die Identifizierung der emittierten fluoreszierenden Gruppen bei unterschiedlichen Wellenlängen kann die Art der verlängerten Basen bestimmt werden, was schließlich in der Sequenzierung der DNA-Vorlage nach der Informationsverarbeitung gipfelt.
Richtlinien zur Einreichung von Proben
