Richtlinien zur Einreichung von Proben
Sanger-Sequenzierung Fragen und Antworten
Allgemeine Fragen
- Warum sagt das Sanger-Sequenzierungsergebnis, dass die Vorlage promiskuitiv ist, wenn der Elektrophorese-Test gut ist?
- Die Ergebnisse der Elektrophorese von PCR-Produkten sind nur ein grobes qualitatives Ergebnis. Unspezifische PCR-Amplifikationsprodukte, die sich nur um wenige Basen von dem Zielfragment unterscheiden, können mit bloßem Auge nicht unterschieden werden. Allerdings, Sanger-DNA-Sequenzierung Reaktionen sind empfindlich und objektiv und können das Template selbst direkt widerspiegeln. Wenn Sie sich über die Reinheit des PCR-Produkts nicht sicher sind, hoffen wir, dass Sie das PCR-Produkt klonieren, um gute Sequenzierungsergebnisse zu gewährleisten.
- Können PCR-Primer als Sanger-Sequenzierungsprimer verwendet werden?
- PCR-Primer können als Sanger-Sequenzierungsprimer verwendet werden, aber je länger der PCR-Primer ist, desto unbefriedigender kann das Sequenzierungsergebnis sein. Daher sind nicht alle PCR-Primer geeignet, um als Sequenzierungsprimer verwendet zu werden.
- Was ist eine Basenlöschung in der Sanger-Sequenzierung?
- Basenlöschungen sind häufig in PCR-Produkten zu finden, insbesondere in PCR-Fragmenten, die aus dem Genom amplifiziert wurden.
- Wie man die Sanger-Sequenzierung zur Aufklärung von Basenlöschungen verwendet.
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(1) Fahren Sie mit der Sequenzierung unter Verwendung von Rückwärtsprimern fort, um die Deletionsstelle zu korrigieren und einen Durchlauf zu erreichen. Alternativ klonen Sie das PCR-Produkt in ein Plasmid und wählen einen einzelnen Klon zur Sequenzierung aus.
(2) Wenn festgestellt werden kann, dass in diesem PCR-Fragment keine fehlende Stelle vorhanden sein sollte, können die PCR-Reaktionsbedingungen geändert und die Amplifikation wiederholt werden.
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(1) Fahren Sie mit der Sequenzierung unter Verwendung von Rückwärtsprimern fort, um die Deletionsstelle zu korrigieren und einen Durchlauf zu erreichen. Alternativ klonen Sie das PCR-Produkt in ein Plasmid und wählen einen einzelnen Klon zur Sequenzierung aus.
- Was sind die Auswirkungen von doppelten Strukturen auf die Sanger-Sequenzierung?
- Duplizierte Strukturen führen zu einem Abrutschen des Sequenzierungsreplikatrahmens und zu Verwirrung des Spitzenmusters nach der duplizierten Struktur.
- Wie man die Sanger-Sequenzierung zur Auflösung von Duplikatstrukturen verwendet?
- Die Sequenzierung der Vorlage mit Rückwärtsprimern zur doppelten Struktur wird das Spleißen der vollen Länge der Vorlage abschließen.
- Was ist das Sanger-Sequenzierungsergebnis der Polystruktur?
- Nehmen wir polyT als Beispiel: Nach der polyA/T-Struktur gibt es häufig Verschiebungen, Doppelspitzen und Spitzenansammlungen, während nach polyG/C oft eine Abschwächung des Sequenzierungssignals oder eine direkte Unterbrechung auftritt.
- Was sieht ein Sequenzierungsgipfel-Diagramm mit einem vorderen bimodalen Ergebnis in der Sanger-Sequenzierung aus?
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(1) Das Produkt enthält ein kleines Fragment eines PCR-Produkts.
(2) Der Primer hat zwei Bindungsstellen und eines der Ergebnisse ist unterbrochen.
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(1) Das Produkt enthält ein kleines Fragment eines PCR-Produkts.
- Wie löst man das bimodale Ergebnis im Sanger-Sequenzieren?
- Reverse-Sequenzierung mit einem anderen Primer.
- Was soll ich tun, wenn es im Sanger-Sequenzieren kein Signal gibt?
- Im Falle der Bestätigung, dass der Primer, die Plasmidextraktionskonzentration, die Reaktionsanordnung und andere Bedingungen in Ordnung sind, wird das Sequenzierungsergebnis mit einem unordentlichen Peak-Muster und einem Signalwert von weniger als 100 als kein Signal für die Sequenzierung gewertet.
- Warum kann ich die Primer in den Sanger-Sequenzierungsergebnissen nicht finden?
- Die Sequenzierungsergebnisse erreichen normalerweise 30-50 bp nach den Primern ihren Höhepunkt, sodass die Primer in den ursprünglichen Ergebnissen nicht zu finden sind.
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Was sind die Ursachen für schwache Sequenzierungssignale bei der Sanger-Sequenzierung?
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(1) übermäßige Menge an Template in der Sequenzierungs-PCR-Reaktion
(2) Abbau von PCR-Produkten
(3) Kontaminanten in der Probe, die die Aktivität der DNA-Polymerase hemmen
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(1) übermäßige Menge an Template in der Sequenzierungs-PCR-Reaktion
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Was ist, wenn das Sequenzierungssignal schwach ist?
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(1) die Menge der Vorlage in der Sequenzierungs-PCR-Reaktion reduzieren
(2) Lagerung von PCR-Produkten bei 4 °C für maximal 48 Stunden, eine Langzeitlagerung bei -20 °C ist erforderlich.
(3) Reinigen Sie die Probe erneut
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(1) die Menge der Vorlage in der Sequenzierungs-PCR-Reaktion reduzieren
- Was sind die Ursachen für ein starkes Sequenzierungssignal in der Sanger-Sequenzierung?
- Die Menge an Template in der Sequenzierungsreaktion ist zu hoch, was zu einem hohen Signal führt.
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Was soll ich tun, wenn das Sequenzierungssignal zu stark ist?
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(1) Re-Kapillarelektrophorese durch Verdünnung des Upload-Produkts mit HIDI
(2) eine kürzere Injektionszeit festlegen
(3) Neuanordnung der PCR und Reduzierung der Menge an Template in der Sequenzierungsreaktion
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(1) Re-Kapillarelektrophorese durch Verdünnung des Upload-Produkts mit HIDI
- Was ist der Grund für die Verzögerung bei der Sequenzierung des Spitzenauftretens in der Sanger-Sequenzierung?
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(1) kapillare Mikro-Blockade
(2) Anwesenheit von Verunreinigungen im Kapillarelektrophoreseprozess
(3) Wenn das BigDye XTerminator-Reinigungskit verwendet wird, gelangen Mikrobeads in der XTerminator-Lösung zusammen mit dem Produkt in die Kapillarelektrophorese, was zu einer abnormalen Zuführung führt.
(4) POP-Gel, Kathodenpuffer, der die Nutzungsdauer überschreitet
(5) Die Menge der Probe, die in die Kapillarelektrophorese eingeht, ist zu hoch.
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(1) kapillare Mikro-Blockade
- Was soll ich tun, wenn es eine Verzögerung bei der Sequenzierung der Peaks gibt?
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(1) Spülen Sie das Kapillarröhrchen mit Fülllösung und führen Sie die Kapillarelektrophorese erneut durch.
(2) Spülen Sie die Gelpumpe und das Rohr mit Waschlösung und führen Sie dann die kapillare Elektrophorese erneut durch.
(3) Re-Kapillarelektrophorese nach BDX-Schütteln und ausreichender Zentrifugation, um die Mikrokügelchen auszufällen.
(4) neuen POP-Gel, Kathodenpuffer ersetzen
(5) Re-Kapillarelektrophorese nach Verdünnung des oberen Produkts mit HIDI oder Verkürzung der Einspritzzeit
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(1) Spülen Sie das Kapillarröhrchen mit Fülllösung und führen Sie die Kapillarelektrophorese erneut durch.
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Was sind die Ursachen für unterbrochene Sequenzierungssignale bei der Sanger-Sequenzierung?
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(1) Signalabfall vor dem Sequenzende A-Peak-Ende: enthält unspezifische amplifizierte Sequenz mit starkem Signal und schwachem Signal der Zielsequenz;
(2) schwere Verschlechterung des Produkts;
(3) Die Verlängerungseffizienz der DNA-Polymerase wird verringert, wenn sie auf komplexe Regionen trifft.
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(1) Signalabfall vor dem Sequenzende A-Peak-Ende: enthält unspezifische amplifizierte Sequenz mit starkem Signal und schwachem Signal der Zielsequenz;
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Was soll ich tun, wenn mein Sequenzierungssignal unterbrochen wird?
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(1) Nukleinsäuren mit erhöhter Probenmenge erneut extrahieren und erneut testen.
(2) Resequenzierung PCR und Reinigung
(3) neue Primer entwerfen oder Rückwärtssequenzierung
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(1) Nukleinsäuren mit erhöhter Probenmenge erneut extrahieren und erneut testen.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
